QuEChERS/超高效液相色譜-串聯質譜法測定茶葉中28種農藥殘留

劉華文,蘇海雁,陸小康,薛亞馨,呂 敏,張榮林,莫 迎

(廣西-東盟食品檢驗檢測中心,廣西南寧 530021)

全球經濟發展迅猛,人們生活水平提高,食品安全也越來越得到人們的重視?，F今農藥在水果蔬菜以及茶葉等農產品上應用十分廣泛,導致農藥殘留量大大增加,如果人們過量攝入殘余農藥則會產生毒副作用[1]危及身體健康,因此提高農殘檢測技術以解決食品安全問題日趨重要[2-5]。近年來,國家不斷完善食品標準,制定嚴格的農藥殘留限量標準[6]。茶葉作為我國傳統飲品,深得人們喜愛,具有延緩衰老、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗動脈硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎以及抗腫瘤作用[7-9]。茶葉需求量和種植面積與日增多,但由于病蟲害影響茶葉的產量與質量,人們為防蟲使用農藥也越來越廣,如有觸殺毒性的樂果、具有胃毒作用的擬除蟲酯類、強殺卵作用的殺螨劑、強滲透作用或腐蝕力的馬拉硫磷、殺菌劑多菌靈等,導致茶葉農藥殘留超出限量范圍,從而制約我國茶葉的發展[10-13]。茶葉中含有茶多酚、咖啡堿、色素等多種物質,基質復雜,且茶葉炒制工藝繁瑣,水分大量丟失,茶葉農藥殘留的檢測一直備受關注。當前,固相萃取法[14]、固相微萃取法[15]、液-液萃取法[16]、加速溶劑萃取法[17]、基質固相分散法[18]等是檢測茶葉中農藥殘留的常用前處理方法,以上方法局限性在于操作方法繁瑣以及試劑消耗量較大。

茶葉成分復雜,農藥殘留分析時干擾嚴重。因此,茶葉需要更具針對性的、抗干擾性更強、更準確快速的農藥殘留檢測方法。QuEChERS是美國Anastassiades教授在農產品檢測方面提出的一種快速樣品前處理技術[19],具有經濟環保、操作簡便、適用范圍廣[20-22]等特點。付曉芳等[23]使用QuEChERS法研究了茶葉中氟蟲腈殘留量的檢測方法。本研究利用QuEChERS方法,根據近年國家監督抽檢茶葉項目和檢出數據,結合GB 2763 - 2019《食品中農藥最大殘留限量》新增的項目,選取茶葉中28種代表性農藥,運用QuEChERS法進行前處理,結合超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)檢測茶葉中農藥的殘留,可用于實驗室日常檢驗,同時把該方法用于Fapas能力驗證,選取28種農藥作為研究對象。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶葉 Fapas能力驗證提供的綠茶,分別為空白茶葉和待測茶葉;28種農藥標準品 德國Dr. Ehrensterfer DmbH公司;乙腈、丙酮、乙酸、甲酸色譜純 德國Merck公司;無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、無水醋酸鈉、乙酸銨分析純 國藥集團化學試劑有限公司;N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18) 天津博納艾杰爾科技有限公司;實驗用水 超純水。

1290超高效液相色譜儀 美國Agilent公司;API 6500三重四級桿串聯質譜儀,配制AB SCIEX數據處理軟件、電噴霧源 美國AB SCIEX公司;MS303TS型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)公司;Multi Reax渦旋儀 德國Heidolph;Shaker SA320振蕩器 日本YAMATO公司;X3R高速冷凍離心機 美國熱電Thermo公司;

1.2 實驗方法

樣品的前處理:提取:稱取粉碎后的茶葉樣品2 g(精確至0.01 g)于50 mL聚丙烯具塞離心管中,分別加入10 mL水和15 mL 1%乙酸乙腈,渦旋混勻2 min,再加入QuEChERS鹽析劑(1.5 g乙酸鈉,6 g無水硫酸鎂),立即搖勻,置于振蕩器上劇烈振蕩3 min(450次/min),置于冰浴中冷卻5 min,以10000 r/min離心5 min,上清液待凈化。

凈化:取上清液1.5 mL置于已預先裝有150 mg無水硫酸鈉、50 mg C18、50 mg PSA凈化材料的15 mL離心管中,渦旋30 s使其充分混勻,再置振蕩器上激烈振蕩5 min(450次/min)使其凈化完全,以10000 r/min離心5 min,濾過(0.22 μm有機濾膜),待檢測。

1.3 色譜條件

色譜柱:Capcell PakBB-H C18液相色譜柱(3.0 μm,2.1 mm×150 mm,日本SHISEIDO公司);流動相:A為5 mmol/L乙酸銨(含0.05%甲酸),B為甲醇(含0.05%甲酸)。梯度洗脫程序:0～2.0 min,90% A;2.0～10.0 min,90%～60% A;10.0～20.0 min,60%～5% A;20.0～25.0 min,5% A;25.0～25.1 min,5%～90% A;25.1～30.0 min,90% A;流速:0.30 mL/min;柱溫:35 ℃;進樣量:5.0 μL。

1.4 質譜條件

離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子掃描模式;檢測方式:多反應檢測模式;電噴霧電壓:5500 V;霧化氣(氮氣)壓力:50.0 psi;輔助氣壓力:60.0 psi;氣簾氣(氮氣)壓力:20.0 psi;碰撞氣(氮氣)壓力:7.0 psi;離子源溫度:550 ℃;掃描時間:60 ms;碰撞室入口電壓:7 V;碰撞室出口電壓:12 V;各目標化合物的質譜采集參數見表1。

1.5 基質匹配工作曲線的配制和繪制

標準儲備溶液:分別準確稱取適量標準物質,用乙腈或丙酮配制成1000 mg/L的標準儲備溶液,-20 ℃保存。分別移取一定體積的各標準儲備液于100 mL棕色容量中,用乙腈定容至刻度,得到1 mg/L的混合標準溶液,用于繪制標準曲線。

取空白基質樣品,按“1.2”處理后,適量加入上述配制的混合標準工作液,定容至1.0 mL,渦旋混勻,濾過(0.22 μm有機濾膜),上機測定,繪制標準工作曲線。

1.6 數據處理

分別利用Analyst Software和MutiQuant 3.0.2軟件(AB SCIEX)進行數據采集及處理,Excel 2013進行數據匯總和分析。

表1 28種農藥的質譜采集參數Table 1 MS acquisition parameters of 28 kinds of pesticides

續表

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

分別配制0.1 μg/mL的各化合物標準品,使用電噴霧質譜用蠕動泵持續進樣,與適當流速的流動相混合后注入質譜,優化噴霧電壓、噴霧器溫度等質譜參數,由于大部分化合物結構中含有N、P和鹵代烴,易形成[M+H]+、[M+Na]+等加合離子,適用于ESI+掃描模式,且響應強度較好。調整噴針的電壓,降低基質等雜質帶來的干擾。優化錐孔電壓使母離子響應豐度最大且穩定,同時優化碰撞能量,選取響應豐度較高、易得到、出峰穩定的碎片離子作為子離子,再通過配制茶葉基質標準溶液,排除易受基質干擾的碎片,確定定性離子對及定量離子對,具體質譜參數見表1。

2.2 色譜條件優化

在優化的質譜條件下,考察不同色譜柱和不同流動相對目標物質譜信號的影響。本實驗對比了3種色譜柱,Waters Atlantis T3色譜柱(3.0 μm,2.1 mm×150 mm),SHISEIDOCapcell Pak BB-H C18色譜柱(3.0 μm,2.1 mm×150 mm),大曹三耀Capcell Core C18色譜柱(2.7 μm,2.1 mm×150 mm)。分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇(0.05%甲酸)-5 mmol/L乙酸銨溶液(0.05% 甲酸)、乙腈(0.05%甲酸)-5 mmol/L乙酸銨溶液(0.05% 甲酸)幾種流動相對目標化合物的影響。結果顯示使用SHISEIDO BB-H C18色譜柱和甲醇(0.05%甲酸)-水(5 mmol/L乙酸銨0.05%甲酸)體系,適用性更好。甲醇較乙腈在離子響應及分離度上更好,而加入了甲酸可以明顯提高28種農藥殘留的離子化效率,乙酸銨能有效解決峰拖尾和提高信號響應。在梯度洗脫條件下農藥出峰均勻,峰形尖銳,分離度好,保留時間適中。28種農藥的總離子流圖見圖1。

圖1 28 種農藥的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram(TIC)of 28 pesticide residues

2.3 提取條件的優化

在貯藏運輸過程中,要保持茶葉含水量低于10%,才能避免茶葉處于活躍狀態,產生霉變[24]。目前,在茶葉農殘檢測中,對提取方法中是否加水存在較多的爭議。有研究表明[25],茶葉加水提取的上層清液顏色明顯比不加水提取的顏色深,加水提取后大量色素類物質溶出,其基質影響明顯高于不加水提取,不利于后續的凈化過程,造成提取回收率較差。但在歐盟EN15662-2008[26]中提到使用QuEChERS方法,當樣品含水量<80%時,需要提前補水至100%。本實驗對比了加水與不加水兩種條件對于茶葉中農藥提取的影響。同時本實驗也比較了乙腈、丙酮、乙酸乙酯及1%乙酸乙腈作為提取溶劑時,對茶葉中農藥的提取效果。結果顯示,加水后1%乙酸乙腈作為提取溶劑,對各農藥均有較好的提取效果,對茶葉基質有較強的滲透作用,加水后噠螨靈、滅多威等農藥提取效率明顯高于不加水的提取過程,同時加入1%乙酸酸化,避免堿性或中性環境下不穩定的農藥的降解和損失。加水浸泡的時間越長,提取的共萃物就越多。LC-MS/MS在m/z 50～2000范圍內全掃描得到的總離子圖顯示,提取液的共萃物更少(圖2)。因此,本實驗采取加水提取,1%乙酸乙腈作為提取溶劑提取茶葉中的農藥。

2.4 凈化條件

圖2 丙酮(A)、乙酸乙酯(B)、1%乙酸乙腈(C)、乙腈(D)作為提取溶劑的總離子流圖Fig.2 TIC of the acetone(A),ethyl acetate(B),1% glacial acetic acid acetonitrile(C)and acetonitrile(D)as solvents for extraction

樣品茶葉含有多種色素,經過有機溶劑提取后,樣液呈墨綠色,共萃雜質多,直接進儀器分析,既污染分析柱和離子源,又影響儀器的響應。目前凈化基質常用的吸附劑有PSA、C18、GCB和MWCNTs。PSA的表面鍵合極性官能團,具有極性吸附作用和弱陰子交換功能[27],能有效去除樣品基質中的有機酸、色素和糖類雜質；GCB具有片狀結構,是一種非極性吸附劑,主要用于去除樣品中的色素、甾醇和維生素,對含苯環官能團的化合物有較強的吸附作用；C18的有效成分是硅膠鍵合的十八烷基,具有疏水性,主要是去除脂肪和非極性物質；MWCNTs比表面積大,吸附能力強,能有效的吸附色素和雜質。但是各種凈化劑在去除雜質的同時也會吸附目標化合物。研究中加入150 mg無水硫酸鎂,旨在去除提取液中的水,保證其他凈化填料的吸附效果。由于GCB和MWCNTs能夠強烈吸附各種化合物,同時無選擇性的對非極性農藥也有吸附作用,降低大部分農藥的回收率。因此,本實驗選取PSA、C18作為凈化填料,比較了不同配比PSA、C18的凈化效果。取1.5 mL提取液,固定加入10 mg PSA,分別考察C18添加量為10、20、40、50、60、80 mg的回收率,在C18添加量為50 mg時,各農藥的回收率最佳;固定C18用量,比較PSA添加量10、20、40、50、60、80 mg的回收率,在PSA添加量為50 mg時,各農藥的回收率達到最佳,最終凈化配比確定為C1850 mg、PSA 50 mg,在此凈化配比下,添加10、50、80 ng/mL濃度水平的28 種目標化合物混合標準溶液的回收率(圖3)。

圖3 28種農藥的回收率Fig.3 Recoveries of 28 pesticides

2.5 基質效應

基質效應(Matrix effect)是指樣品中的其他成分對目標分析物離子響應強度的影響,即基質對分析方法準確性的干擾。LC-MS/MS 的基質效應由分析物的共流出組分影響電噴霧離子源的離子化效率所致,也被認為是誤差的重要來源,常會導致檢測結果偏高或偏低,ESI容易受樣品基質的影響,一般使用正離子模式進行檢測時,會產生較強的基質抑制效應?；|效應可采用以下公式進行計算:

式中:ME為基質效應;A為溶液標準曲線的斜率;B為基質匹配標準曲線的斜率。

若ME<1,則表現為基質抑制效應,ME>1,則為基質增強效應。本實驗對28種化合物的基質效應進行了評估(見圖4),發現吡蟲啉、稻豐散、啶蟲脒、毒死蜱、二唑磷、甲基嘧啶磷、喹螨醚、樂果、綠谷隆、馬拉硫磷、嘧霉胺、肟菌脂、乙硫磷、唑蟲酰胺、喹硫磷等基質抑制效應不明顯;化合物噠螨靈、甲萘威、滅多威、炔螨特、噻嗪酮機制抑制效應較為明顯;化合物毒蟲畏、呋蟲胺、溴氰菊酯存在基質增強效應,而以多菌靈、久效磷、三唑磷、特丁津、沙螟硫磷最為明顯。因此,本方法采用配制基質匹配標準工作溶液的方法消除基質影響,能夠滿足農藥殘留的檢測要求。

圖4 28種農藥在茶葉中的基質效應Fig.4 Matrix effects of 28 pesticides in tea

2.6 線性范圍、檢出限與定量限

在優化實驗條件下,按“1.5”方法配制6個濃度水平的基質匹配混合標準工作溶液,上機測定,以目標物的質量濃度為橫坐標,對應的定量離子峰面積為縱坐標繪制標準曲線。28種目標化合物在各自范圍內線性良好,相關系數(r)為0.990～0.998。采用標準添加法進行測定,以定量離子信噪比S/N≥3得到28種目標化合物的檢出限(LOD)為0.08～1.26 μg/kg,以S/N≥10得到定量限(LOQ)為0.28～4.20 μg/kg(見表2),滿足農藥殘留的檢測要求。

表2 28種待測物的基質效應、檢出限、定量限、線性范圍、平均回收率和相對標準偏差(n=6)Table 2 Matrix effects,LOD,LOQ,linear ranges,average recoveries and relative standard deviations of 28 analytes(n=6)

2.7 回收率與相對標準偏差

向空白基質樣品中添加3個濃度水平(10、50、80 μg/kg)的28種目標化合物混合標準溶液,按“1.2”方法進行前處理后上機測定,每個濃度水平做6個平行試驗。計算得到28種待測物的平均回收率均在72.5%～118.5%范圍內,相對標準偏差(RSD)為0.8%～16.3%(見表2)。

2.8 本法與國家標準方法的比較

以綠茶為例,參照國家標準方法GB 23200.13 -2016[28]農藥的回收率作為理論數值,考察本法的回收率,結果列于表3。結果表明,QuEChERS方法的回收率在72.5%～118.5%之間,國家標準方法的回收率在64.2%～114.8%之間。國家標準方法中嘧霉胺回收率為(0.0%～0.0%),可能加入1 LOQ濃度水平,儀器的靈敏度不高,致使無法檢測;炔螨特的回收率為(107.6%～141.7%),可能為基質效應影響。QuEChERS方法的回收率較國家標準方法的回收率有明顯提升,同時省略過柱的步驟,減少有機試劑的使用和實驗時間。該方法既保證實驗結果的準確性和穩定性,又大大提升檢驗效率。另外,本研究方法還提供噠螨靈、毒蟲畏、呋蟲胺、久效磷、肟菌脂、溴氰菊酯、唑蟲酰胺、嘧霉胺和炔螨特的回收率,為補充標準方法提供數據積累。

表3 QuEChERS方法與國家標準方法 對28種農藥回收率的對比Table 3 Comparison of recoveries of 28 pesticides between QuEChERS and the nationl standaeds

續表

表4 QuEChERS方法和國家標準方法 2種農藥結果與Fapas結果定值的對比Table 4 Comparison of Fapasassigned value of 2 pesticides between QuEChERS and the nationlstandaeds

2.9 實際樣品檢測

利用本法和國家標準方法GB 23200.13 -2016對Fapas能力驗證的茶葉樣品進行測試,樣品中檢出毒死蜱和殺螟硫磷的結果列于表4,結果滿意,說明本法的準確性較高。

3 結論

本文采用QuEChERS方法進行前處理,以超高效液相色譜-串聯質譜為檢測儀器,建立茶葉中農藥殘留的篩查檢測方法。在最優實驗條件下,28種農藥在3個添加水平下的回收率為72.5%～118.5%,檢出限為0.08～1.26 μg/kg,定量限0.28～4.20 μg/kg,RSD為0.8%～16.3%,滿足農藥殘留的檢測要求。與傳統樣品預處理方法相比,在保證方法的靈敏度、精密度和適用性的基礎上,該方法樣品前處理成本低,簡便快速,靈敏可靠,適合于茶葉中農藥殘留的定性、定量分析。