三種提取方法對紅花椒揮發性成分的影響

王雪迪,許朵霞,2,王 蓓,2,王少甲,2,*,曹雁平,2,*

(1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京工商大學,北京 100048; 2.北京市食品添加劑工程技術研究中心,北京工商大學,北京 100048)

花椒為蕓香科花椒屬植物,是中國傳統調味料之一,主要種植于熱帶和亞熱帶地區[1]。全世界花椒屬約有250種,我國約有45種,主要包括竹葉椒、野花椒、川陜花椒等[2]。花椒具有廣泛的應用,不僅具有食用價值,而且具有藥用價值,可散寒祛濕、止泄止痛、殺蟲止癢等[3]。花椒是我國傳統的調味料,因其獨特的香氣深受大眾喜愛[4]。花椒中含有多種揮發性成分,比如烯烴類的檸檬烯、月桂烯等,醇類的芳樟醇、γ-萜品醇等,酯類的乙酸芳樟酯、乙酸松油酯等,醛類的2,4-己二烯醛、巴豆醛等,以及酮類、酸類、烷烴等[5]。

目前對花椒揮發性成分的提取方法主要有有機溶劑萃取法、水蒸氣蒸餾法和超臨界CO2萃取法[6],不同提取方法會造成花椒提取物中揮發性成分組成的差異,孟慶軍等[7]采用水蒸氣蒸餾法、植物油浸提法、食用酒精提取法、無水乙醚提取法、超臨界二氧化碳流體萃取法提取花椒的有效成分,結果表明五種方法所得產物提取率和有效成分含量存在明顯差異,其中超臨界二氧化碳提取所得產品的有效成分含量和提取率最高;植物油浸提所得產品的品質較好,但有效成分提取率偏低;水蒸氣蒸餾法只能得到花椒揮發油;食用酒精提取法和無水乙醚提取法獲得了大部分花椒麻素和少量的揮發油。石雪萍等[8]研究發現超臨界CO2萃取法與水蒸氣蒸餾法萃取花椒主要揮發性成分均為檸檬烯、沉香醇和羅勒烯,但占比不同。提取參數的變化也會導致花椒揮發性成分含量的變化,王芳等[9]采用油浸法浸提花椒,評價了參數改變對花椒麻素、檸檬烯和芳樟醇濃度的影響,浸取溫度、時間和料液比的變化都導致了三種物質濃度的變化,其中花椒麻素在浸取30 min時濃度達到3 mg/mL以上,是浸取10 min濃度的3倍以上。

盡管已有研究對不同方法對花椒提取物揮發性成分的差異進行了對比,但多停留在對某幾種高含量揮發性物質的比較,缺乏系統性與全面性,同時缺乏對關鍵香氣物質的比較。因此,本文采用固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術對油浸法、水蒸氣蒸餾法及超臨界CO2萃取法獲得的花椒提取物揮發性成分進行了比較,并采用主成分分析法對提取方法和提取參數變化引起的花椒提取物揮發性成分種類及含量的差異進行系統分析,同時重點分析關鍵香氣物質的變化。期望通過對比不同浸取方法以及每種方法的浸取參數對花椒提取物風味的影響,獲得在不同條件下花椒的揮發性成分種類及含量的變化,以期為不同風味花椒產品的開發提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅花椒 產地四川;菜籽油 金龍魚食品有限公司;無水乙醇 分析純,北京化工廠;1,2-二氯苯(1.306 g/mL) 色譜純,麥克林生化科技公司;二氯甲烷 色譜純,北京伊諾凱科技有限公司。

HH-ZK1恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司;HH數顯恒溫油浴槽 江蘇正基儀器有限公司;FW135中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;Spe-ed超臨界萃取裝置 美國Applied Separations公司;7890B-5977A氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司;40 mL頂空瓶 美國Agilent公司;DB-WAX毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm) 美國Agilent公司;手動固相微萃取進樣器、50/30 μm DVB-CAR-PDMS 美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花椒提取物制備 將花椒置于鼓風干燥箱中80 ℃烘干2 h后粉碎過40目篩得到花椒粉備用。

油浸法:取花椒粉20 g置于燒杯中,加入菜籽油(常溫20 ℃)混合均勻,在設定溫度下浸取一定時間后過濾除去殘渣得到花椒油待檢測,控制浸提溫度為100 ℃,浸提時間為4 h,選取料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25;控制料液比為1∶10,浸提時間為4 h,選取溫度為60、80、100、120、140 ℃;控制料液比為1∶10,浸提溫度為100 ℃,選取浸取時間為1、2、3、4、5 h。

水蒸氣蒸餾法:取花椒粉末20 g置于圓底燒瓶中,以不同液料比加入冷水浸泡12 h,向圓底燒瓶中加入數粒玻璃珠后,置于電熱套中加熱一定時間,蒸餾完成后置于分液漏斗中,放掉下層水,上層揮發油放置含有無水硫酸鈉的干燥器中干燥后,得到澄清透明的花椒油待檢測,控制蒸餾時間為4 h,選取料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25;控制料液比為1∶10,選取蒸餾時間為1、2、3、4、5 h。

超臨界CO2萃取法:取花椒粉末20 g裝入萃取釜中,以不同乙醇作為夾帶劑進行萃取,控制乙醇添加量為3%,選取乙醇濃度為65%、75%、85%、95%、100%;控制乙醇濃度為100%,選取乙醇添加量為3%、5%、7%、10%、15%。

1.2.2 揮發性物質分離與檢測 本研究采用固相微萃取(SPME)結合氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用對花椒風味物質進行檢測。取制備好的花椒提取物樣品200 μL裝入萃取瓶中并加入1 μL內標物1,2-二氯苯(0.0653 μg/μL),加蓋密封后放入60 ℃水浴鍋中平衡30 min,待樣品平衡時間結束后,將活化好的SPME萃取頭插入樣品瓶中吸附30 min,萃取結束后把萃取頭退回,拔出萃取針,立即插入儀器進樣口,推出萃取頭,在250 ℃下解析5 min。氣相色譜條件:色譜柱為DB-WAX毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm);升溫程序:初始溫度40 ℃,保持1 min,以8 ℃/min 升至140 ℃,保持3 min,再以5 ℃/min升至230 ℃,保持1 min;載氣為高純He,柱流量為1 mL/min,進樣口溫度為250 ℃,分流比為10∶1。質譜條件:質譜接口溫度250 ℃,EI離子源,電離能量70 eV,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,掃描模式為全掃描,掃描范圍m/z 40～500。

1.2.3 定性與定量分析 經MassHunter化學工作站處理,篩除由萃取頭帶來的硅氧烷雜質峰,與標準譜庫NIST14進行比對,僅當匹配值大于800時保留該物質,通過計算實際RI值,與經CAS號查詢的理論RI值進行比對,當差值小于100時保留該物質。RI值測定方法:在相同的色譜條件下,將正構烷烴C7～C40與花椒相同的色譜條件下測得。RI值的計算方法如公式(1):

式(1)

式中:RI,保留指數;n,碳原子數;ti,樣品i的保留時間min;tn,碳原子數為n的烷烴的保留時間min;tn+1,碳原子數為n+1的烷烴的保留時間min。

定量分析采用內標半定量方法,根據化合物及內標化合物1,2-二氯苯峰面積比值計算揮發性成分的含量。

1.2.4 關鍵性物質評價方法 采用香氣活度值(ROAV)對風味物質進行評價,定義對樣品貢獻最大組分的ROAVmax為100,其他香氣成分ROAV值計算方法如公式(2):

式(2)

其中:Ci、Ti分別為各揮發性物質的含量和對應的感覺閾值;Cmax、Tmax分別為對樣品總體風味貢獻最大的組分的含量和對應的感覺閾值。

1.3 數據分析

使用軟件SPSS 21.0進行主成分分析,使用Excel 2016進行熱圖繪制和其他數據處理。

2 結果與分析

2.1 三種提取方法提取花椒揮發性物質的總離子流圖

對三種提取方法揮發性物質總離子流圖進行分析,發現揮發性物質峰總數和豐度存在明顯差異,其中超臨界CO2萃取和水蒸氣蒸餾法提取物揮發性物質有效峰的數量和豐度均高于油浸法提取物。從圖1中還可以看出提取方法對同一種物質也有較大影響,如30.739 min檢測到的花椒素峰值在超臨界CO2萃取提取物中遠高于另兩種花椒提取物。

圖1 不同提取方法提取花椒揮發性物質總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of volatile compounds extracted from Zanthoxylum bungeanum by different extraction methods注:油浸法提取參數為料液比1∶10、浸提時間4 h、 浸提溫度100 ℃;水蒸氣蒸餾法提取參數為料液比1∶10、 浸提時間2 h;超臨界CO2萃取法提取參數為 乙醇含量100%、乙醇添加量3%。

2.2 提取方法對花椒提取物揮發性物質種類的影響

三種提取方法制得花椒提取物揮發性成分數量和種類差異較大,油浸法樣品中共鑒定出揮發性物質65種,其中烯烴22種、醇類16種、酯類6種、醛類6種、酮類4種、烷烴1種,酸類2種、其他類8種;水蒸氣蒸餾法樣品中共鑒定出揮發性物質100種,包括烯類32種、醇類32種、酯類9種、醛類6種、酮類4種、烷烴類3種,酸類1種及其他類13種;超臨界CO2萃取樣品中共鑒定出揮發性物質82種,包括烯類34種、醇類22種、酯類8種、醛類5種、酮類1種、烷烴類4種、酸類1種及其他類7種。所有揮發性物質中有33種物質在三種提取方法得到的提取物中均能檢測到,包括D-檸檬烯、檜烯等在內的18種烯烴;包括芳樟醇、橙花醇等在內的8種醇類物質;包括乙酸芳樟酯、乙酸松油酯在內的4種酯類物質以及對異丙基苯甲醛、香芹酚和花椒素。而有72種揮發性物質僅在某一種提取方法產物中檢測到,其中油浸法產物中鑒定出19種,水蒸氣蒸餾法產物中鑒定出34種,超臨界CO2萃取產物中鑒定出18種。

圖2 不同提取方法對揮發性物質種類及數量的影響Fig.2 Effects of different extraction methods on the types and quantity of volatile substances注:每種提取方法揮發性物質種類 和數量是該方法所有樣品數據匯總得到的。

僅在油浸法產物中鑒定出的19種揮發性物質包含4種烯烴、4種醇類物質、2種醛類物質、3種酮類物質、1種烷烴、1種酸類物質及4種其他類物質,其中月桂烯、正己醛和反式-2-癸烯醛具有明顯的油脂香氣,特別是月桂烯濃度高閾值低,對油浸法產物的獨特香氣貢獻大[10]。僅在水蒸氣蒸餾法產物中鑒定出的34種揮發性物質包含6種烯烴、12種醇類物質、2種酯類物質、1種醛類物質、2種酮類物質、2種烷烴、1種酸類物質及8種其他類物質,其中乙酸香葉酯、紫蘇醛和香芹酮分別具有玫瑰花香、脂類香氣和薄荷香氣[11-13]。僅在超臨界萃取產物中鑒定出的18種揮發性物質包含7種烯烴、3種醇類物質、1種酯類物質、1種醛類物質、3種烷烴及3種其他類物質,其中α-法呢烯和γ-杜松烯具有木香[14]。

2.3 油浸法產物揮發性成分分析

油浸法是花椒風味物質提取的傳統方法之一[15],本文對料液比、浸取溫度、浸取時間對揮發性物質的影響進行了研究。如圖3所示,隨著浸取溶劑用量的增加,花椒在植物油中的比例逐漸減小,揮發性物質總含量逐漸降低,料液比為1∶5時揮發性物質含量最高,達到249.38 μg/mL。隨著浸取溫度和時間增加揮發性物質總含量沒有明顯變化趨勢,在浸取溫度為140 ℃和浸取時間5 h時達到最大值163.94和189.18 μg/mL。油浸法樣品中共鑒定出的65種揮發性物質,其中26種物質具有香氣,香氣物質總含量占揮發性物質總含量的70%以上。

圖3 油浸法浸提條件對揮發性物質含量的影響Fig.3 Effect of oil extraction conditions on volatile matter content注:HY1～HY5為料液比1∶5～1∶25; HY6～HY10為浸提時間1～5 h; HY11～HY15為浸提溫度60～140 ℃,圖4、表3同。

如圖4所示,香氣物質含量與揮發性物質總含量變化趨勢相同,分別在料液比為1∶5、浸取溫度140 ℃、浸取時間5 h時達到最大值170.99、111.23與133.63 μg/mL。

主成分分析能更好地反映樣品品質[16-18],從表2可以看出,前3個主成分包含了83.89%的信息,能很好的表示26種香氣成分的變化趨勢。根據主成分分析各組得分結果(表3)發現油浸法樣品品質變化趨勢與揮發性物質總含量變化趨勢相同。揮發性物質總含量與香氣物質主成分分析結果都顯示HY1、HY10、HY15組樣品品質最好,盡管其中含量最高的6種物質月桂烯、燴烯、反式-β-羅勒烯、β-水芹烯、D-檸檬烯和乙酸松油酯并未在140 ℃時達到最大值,月桂烯含量甚至隨著溫度升高下降,但由于高溫導致更多香氣物質生成,同時含量最高的幾種香氣物質也保持較高水平。根據揮發性物質總含量及主成分分析結果顯示在料液比為1∶5、浸提溫度為140 ℃、浸提時間為5 h時,花椒提取物品質最好。

圖4 油浸法香氣物質熱圖Fig.4 Heat map of aroma substances by oil immersion method

表2 主成分的特征值及其方差貢獻率Table 2 Principal component eigenvalues and contribution rates

表3 油浸法各組綜合得分Table 3 Comprehensive scores of each group of oil immersion method

2.4 水蒸氣蒸餾產物揮發性成分分析

水蒸氣蒸餾法是提取花椒油常用的方法之一[19-20],本論文對料液比和蒸餾時間對揮發性物質的影響進行了研究。揮發性物質總含量分別在料液比1∶10和蒸餾時間2 h時達到最大值,分別為1033.96和1152.61 μg/mL(圖5)。

圖5 水蒸氣蒸餾法蒸餾條件對揮發性物質含量的影響Fig.5 Effect of distillation conditions on the content of volatile substances in steam distillation注:HS1～HS5為料液比1∶5～1∶25; HS6～HS10為蒸餾時間1～5 h,圖6、表6同。

如圖6所示,通過查閱文獻[21-23],選取揮發性物質中具有香氣且相對含量高于1 μg/mL的物質中共有46種物質,占揮發性物質總含量的65%以上。其變化與揮發性物質總含量變化趨勢相同,在料液比為1∶10時香氣成分含量達到792.81 μg/mL。蒸餾2 h樣品香氣成分含量達到883.05 μg/mL。

圖6 水蒸氣蒸餾法香氣物質熱圖Fig.6 Heat map of aroma substances by steam distillation

主成分分析能更好地反映樣品品質,從表5可以看出,前3個主成分包含了80.03%的信息,能表示46種香氣成分的變化趨勢。根據主成分分析結果(表6)發現水蒸氣蒸餾樣品品質變化趨勢與揮發性物質總含量變化趨勢相同。而香氣物質含量最高的4種物質桉樹醇、芳樟醇、4-萜烯醇、乙酸松油酯以及水蒸氣蒸餾法樣品中獨有的香氣物質乙酸香葉酯、香芹酮物質含量變化趨勢與主成分分析得分變化趨勢不同。綜上所述,在料液比為1∶10、蒸餾時間為2 h時樣品揮發性物質含量及香氣物質含量達到最大。

表5 主成分的特征值及其方差貢獻率Table 5 Principal component eigenvalues and contribution rates

表6 水蒸氣蒸餾法各組綜合得分Table 6 Comprehensive scores of each group by steam distillation

2.5 超臨界CO2萃取產物揮發性成分分析

超臨界CO2萃取技術是萃取精油最常用的方法之一[24-25],本論文對夾帶劑無水乙醇的添加量和乙醇比例對揮發性物質的影響進行了研究。如圖7所示，隨著無水乙醇添加量的增加,揮發性物質總含量在添加量為7%時達到峰值12389.80 μg/mL。隨著乙醇比例的增加,揮發性物質總含量在乙醇比例為85%時達到峰值13909.90 μg/mL。

圖7 超臨界萃取法萃取條件對揮發性物質含量的影響Fig.7 The influence of supercritical extraction conditions on volatile matter content注:HC1～HC5為無水乙醇添加量3%～15%; HC6～HC10為乙醇比例65%～100%,圖8、表9同。

如圖8所示,通過查閱文獻[21-23],選取揮發性物質中具有香氣且含量高于1 μg/mL的物質中共有51種物質,占揮發性物質總含量的55%以上。其變化與揮發性物質總含量變化趨勢相同,在無水乙醇添加量為7%時香氣成分總含量達到7712.6 μg/mL。乙醇比例為85%時樣品香氣成分總含量達到8417.47 μg/mL。

根據主成分分析各組得分結果(表9)發現,超臨界CO2萃取樣品品質變化趨勢與揮發性物質總含量變化趨勢相同。香氣成分中含量最高的4種物質石竹烯、大牛兒烯 D、γ-杜松烯和乙酸松油酯含量變化符合主成分分析結果。綜上所述,添加量為7%、乙醇比例為85%時,樣品揮發性物質含量及香氣物質含量最大。

表8 主成分的特征值及其方差貢獻率Table 8 Principal component eigenvalues and contribution rates

圖8 超臨界CO2萃取法香氣物質熱圖Fig.8 Thermogram of aroma substances by supercritical CO2 extraction

表9 超臨界CO2萃取法各組綜合得分Table 9 Comprehensive scores of each group by supercritical CO2 extraction

2.6 提取方法對關鍵香氣成分的影響

為進一步分析不同提取方法對花椒香氣的影響,采用相對氣味活度值(ROAV)評價不同提取方法樣品[21],物質的ROAV值越大對樣品總體風味貢獻程度越大,當物質的ROAV≥1時該物質為樣品中的關鍵風味物質,而當物質的ROAV值介于0.1～1之間時該物質則對樣品總體風味起到修飾作用。如表10所示，油浸法樣品中月桂烯相對氣味活度值最大,定義其ROAVmax為100,其余ROAV大于1的香氣成分有芳樟醇、D-檸檬烯、反式-β-羅勒烯和羅勒烯,它們對油浸法樣品香氣起主要作用,α-蒎烯、α-松油烯、β-水芹烯、石竹烯和4-異丙烯基甲苯對香氣起修飾作用。當溫度到達140 ℃,或者浸取時間5 h時,對樣品香氣起主要作用的幾種物質ROAV均達到最大值,意味著除月桂烯外的幾種香氣物質對樣品總香氣貢獻達到最大。

水蒸氣蒸餾法不同參數處理樣品中相對氣味活度值最大的物質不同,在料液比1∶5、1∶15、1∶20、1∶25樣品中芳樟醇的相對氣味活度值為100,其他樣品中桉樹醇的相對氣味活度值為100。由表11可知,除芳樟醇及桉樹醇外,α-水芹烯、D-檸檬烯、石竹烯及香芹酮對水蒸氣蒸餾法樣品香氣起主要作用,其余物質則起到修飾作用。隨著料液比的降低,香氣物質變化趨勢并不一致,但值得注意的是乙酸香葉酯在料液比低于1∶15后對樣品香氣不再有貢獻,(E)-巴豆醛在蒸餾時間達到3 h以上后同樣失去了對樣品香氣的貢獻。

超臨界CO2萃取法樣品中芳樟醇的相對氣味活度值ROAVmax為100。由表12可知,除芳樟醇外,(E)-巴豆醛、D-檸檬烯、桉樹醇、反式-β-羅勒烯、羅勒烯、石竹烯及乙酸松油酯對萃取法樣品香氣起主要作用,其余物質起到修飾作用。(E)-巴豆醛在夾帶劑乙醇含量超過5%時不再對樣品香氣有貢獻,庚二烯醛更是在乙醇含量超過3%以后對香氣不再有貢獻。

比較三種提取方法樣品香氣貢獻成分,超臨界CO2樣品主要貢獻成分最多共有8種,水蒸氣蒸餾法有6種,油浸法5種。三種提取方法樣品均存在獨有香氣物質,月桂烯僅對油浸法樣品香氣有貢獻,α-水芹烯和香芹酮僅對水蒸氣蒸餾法樣品香氣有貢獻,(E)-巴豆醛和乙酸松油酯僅對超臨界CO2樣品香氣有貢獻。

表10 油浸法中關鍵揮發性物質Table 10 Key volatile substances in oil leaching

表11 水蒸氣蒸餾法中關鍵揮發性物質Table 11 Key volatile substances in steam distillation

表12 超臨界CO2萃取法中關鍵揮發性物質Table 12 Key volatile substances in supercritical CO2 extraction

3 結論

本論文采用油浸法、水蒸氣蒸餾萃取法和超臨界CO2萃取法提取花椒中的揮發性物質。提取方法的差異會導致花椒提取物中揮發性物質種類及含量的變化,水蒸氣蒸餾萃取花椒提取物中揮發性物質種類最多為100種,油浸法獲得的花椒提取物中揮發性物質最少為65種;超臨界CO2萃取獲得的花椒提取物中揮發性物質含量最高,油浸法最低。提取參數的變化同樣會影響花椒提取物的品質,油浸法樣品中料液比的降低會導致揮發性物質總含量以及主成分分析得分下降,而浸取溫度的提高和浸取時間的增加不能持續提高揮發物質總含量和主成分分析得分,在浸取5 h,溫度140 ℃時揮發性物質總含量達到最大值,但最大香氣貢獻物質月桂烯含量則在溫度為60 ℃時中達到最大值。水蒸氣蒸餾法樣品揮發性物質總含量分別在料液比1∶10,蒸餾2 h時達到最大值。超臨界CO2萃取法樣品揮發性物質總含量分別在無水乙醇添加量為7%,乙醇比例為85%時達到最大值。相對氣味活度值結果表明三種提取方法主要香氣貢獻物質不同,油浸法樣品中月桂烯對香氣貢獻最大,水蒸氣蒸餾法樣品中芳樟醇與桉樹醇對香氣貢獻大,而超臨界CO2萃取法樣品中芳樟醇對香氣貢獻最大。