蟬花孢子粉多糖的酶輔助提取及其對酒精性肝損傷小鼠的保護作用

南婷婷,許東霞,王余宸銘,楊 麗,史 璐,鄭 義,2,*

(1.徐州工程學院食品與生物工程學院,江蘇徐州 221018; 2.江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室,江蘇徐州 221018)

酒精性肝病(Alcoholic liver disease,ALD)是世界上最常見的肝病之一[1],也是我國第二大肝病。ALD初期表現為脂肪肝,可進展為酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝癌等[2]。影響ALD發生和進展的因素很多,主要包括酒精攝入量、飲酒頻次、酒精類別、飲酒方式、性別、種族和遺傳因素等[3]。酒精性肝病的治療方法包括藥物療法、營養療法和肝移植等,目前尚無令人滿意的治療方法[4-6]。乙醇引起的氧化應激被認為是ALD的發病機制之一[7]。長期大量酒精攝入,經肝臟代謝后可導致過量的活性氧(ROS),使肝臟中抗氧化酶活性下降,造成肝細胞損傷[8]。攝入外源抗氧化劑拮抗酒精導致的氧化應激被認為是一種很有前景的ALD治療策略[9]。近年來,在ALD治療藥物的篩選中,生物活性多糖受到廣泛關注,動物實驗表明長根奧德蘑多糖[10]、秀珍菇菌絲體多糖[11]、毛頭鬼傘多糖[12]和云芝菌絲體多糖[13]等大量的真菌多糖具有較好的保肝作用。

蟬花(Cordycepscicadae)又稱蟬草、蟬茸、蟬花等,與冬蟲夏草和蛹蟲草同屬真菌門、子囊菌綱、麥角菌目、麥角菌科、蟲草屬真菌,是我國傳統的中藥材,具有較高的藥食兩用性價值。多糖為蟬花的主要活性成分之一,蟬花孢梗束多糖具有抗氧化[14]、抗衰老[15]和抗腫瘤[16]作用。前期研究表明,蟬花孢梗束多糖可通過提高體內抗氧化酶活性、直接清除自由基和螯合金屬離子等途徑發揮其對環磷酰胺致小鼠肝損傷的保護作用[17]。有關蟬花孢子粉多糖保肝作用的研究未見報道。

傳統的多糖提取方法包括熱水浸提、煎煮提取等。然而傳統方法存在多糖得率低、溶劑消耗大、能耗高、耗時長等缺點,此外這些方法通常對細胞壁的破碎效果不佳。綠色提取是天然產物研究的必然趨勢,綠色提取可提高多糖得率、減少溶劑消耗、降低能耗、減少環境污染。酶輔助提取可以提高多糖的得率,同時維持多糖的結構與生物活性,目前尚未見應用于蟬花孢子粉多糖提取的研究報道。

本研究采用酶輔助提取蟬花孢子粉多糖,通過單因素實驗及響應面法優化酶輔助提取工藝參數,采用急性酒精性肝損傷小鼠模型評價了蟬花孢子粉多糖的保肝作用,旨在為蟬花孢子粉多糖的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蟬花孢子粉 由江蘇省食品資源開發利用與質量安全重點建設實驗室制備;昆明小鼠(18～22 g,6周齡) 濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,生產許可證號SCXK魯20140007;纖維素酶(100000 U/g) 食品級,和氏璧生物科技有限公司;丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)測試盒 南京建成生物工程研究所;水飛薊賓 國藥準字H20040299,天津天士力圣特制藥有限公司。

723C可見分光光度計、FA2104N電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司;PC-1000數顯式電熱恒溫水浴鍋 上海躍進醫療器械廠;TGL-16G型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;SHZ-D(Ш)循環水式真空泵 鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶輔助法提取蟬花孢子粉多糖 稱取蟬花孢子粉1.00 g,置于一定體積、一定pH的檸檬酸緩沖液中,預熱至酶解溫度,加入一定量的纖維素酶,在一定溫度下水浴酶解一段時間。提取后沸水浴滅酶10 min,冷卻,抽濾,濾液濃縮至原體積的1/20,在4 ℃下乙醇(終體積分數80%)沉淀12 h,3000 r/min離心10 min,收集沉淀,所得沉淀用無水乙醇洗滌3次,冷凍干燥后得蟬花孢子粉粗多糖。Sevage法脫蛋白,重復數次,直至兩相界面無蛋白為止。蒸餾水透析48 h,除去Sevag試劑,濃縮,冷凍干燥得蟬花孢子粉多糖。

1.2.2 多糖得率的測定 采用苯酚-硫酸法[18]。配制質量濃度為40 μg/mL的葡萄糖標準溶液,依次吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8 mL,去離子水補至2.0 mL,迅速加入1.0 mL 6%苯酚和5.0 mL濃硫酸,混勻后沸水浴15 min,冷卻后在490 nm處測吸光度。以葡萄糖微克數為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制葡萄糖標準曲線。所得標準曲線方程為y=0.0066x+0.0014,R2=0.9978。取1 mL多糖樣品溶液,參照上述方法測定吸光度,根據葡萄糖標準曲線計算多糖得率。

蟬花孢子粉多糖得率按下式計算:

式中:0.9表示校正系數;W1表示從回歸方程求得的多糖質量,μg;N表示稀釋倍數;V表示反應液體積,mL;W表示稱取的蟬花孢子粉質量,g。

表1 單因素實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of single factor experiments

1.2.3 單因素實驗 通過單因素實驗考察液料比、纖維素酶用量、酶解pH、酶解時間和酶解溫度對酶輔助提取蟬花孢子粉多糖的影響,試驗因素水平如表1所示。每組試驗重復3次。

1.2.4 Box-Behnken試驗設計 在單因素實驗的基礎上,采取Box-Behnken試驗設計,安排四因素三水平試驗,試驗因素水平如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.2.5 小鼠分組與處理 小鼠經7 d適應性飼養后,隨機分為正常組、模型組、陽性對照組和蟬花孢子粉多糖低、中、高劑量組。每組10只小鼠,雌雄各半。陽性對照組灌胃150 mg/kg水飛薊賓,低、中、高劑量組分別灌胃50、100和200 mg/kg蟬花孢子粉多糖,每天1次,連續20 d;正常組和模型組每天灌胃等量去離子水。第21 d,除正常組外,其余組小鼠灌胃50%乙醇(12 mL/kg),每隔12 h一次,連續3次;正常組每次灌胃等體積去離子水。

1.2.6 生化指標檢測 在末次灌胃50%乙醇12 h后,小鼠稱重,眼眶靜脈叢采血,血樣于室溫靜置1 h,在4 ℃下,3500 r/min離心10 min,收集血清,按照試劑盒說明書測定血清中ALT和AST活性。頸椎脫臼法處死小鼠,取肝臟和脾臟,稱重臟器,根據臟器質量與其體重比,計算臟器系數。取肝臟,加適量預冷生理鹽水,制成10%(m/V)肝組織勻漿,在4 ℃下,3500 r/min離心10 min,收集上清液,根據試劑盒說明書測定肝組織中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量。

1.3 數據處理

采用SPSS 24.0軟件進行數據分析,結果采用平均值±標準差表示。組間比較采用Dunnett-t檢驗,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 液料比對多糖得率的影響 如圖1所示,當液料比在15～30 mL/g之間時,蟬花孢子粉多糖得率隨液料比的增加而升高,當液料比高于30 mL/g時,多糖得率的增加趨于平緩。料液比影響溶液的黏度和濃度,當其較小時,溶液黏度大,酶分子不易擴散,得率小;當其逐漸升高時,酶分子擴散快,得率高;當升高到達一定程度時,由于濃度差變小,得率趨于平衡。液料比過大,將會導致后續操作能耗增加,故料液比取30 mL/g左右最佳。

圖1 液料比對酶輔助提取蟬花孢子粉多糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid to material ratio on yield of CCSP

2.1.2 纖維素酶用量對多糖得率的影響 圖2為不同纖維素酶用量對酶輔助提取蟬花孢子粉多糖得率的影響。當酶用量在0.2%～0.6%之間時,蟬花孢子粉多糖得率隨酶用量的增加而升高,當酶用量高于0.6%時,多糖得率的增幅趨于平緩。這是因為浸提體系中酶分子已接近飽和狀態,致使多糖得率增長平緩。考慮酶的成本,故酶使用量確定為0.6%左右。

圖2 纖維素酶用量對蟬花孢子粉多糖得率的影響Fig.2 Effect of cellulase amount on the yield of CCSP

2.1.3 酶解pH對多糖得率的影響 如圖3所示,多糖得率隨pH的升高而先增加后減少,并在pH為6.0時達到最大值,這表明纖維素酶催化水解蟬花孢子細胞壁較適宜的pH在6.0左右,低于或高于適宜pH時,酶的活性降低,從而導致多糖得率降低。故選擇較優酶解pH為6.0左右。

圖3 酶解pH對蟬花孢子粉多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis pH value on the yield of CCSP

2.1.4 酶解時間對多糖得率的影響 圖4為不同酶解時間對酶輔助蟬花孢子粉多糖得率的影響。當酶解時間在20～80 min之間時,多糖得率隨酶解時間的延長而增加,當酶解時間超過80 min時,多糖得率的增加趨于平緩,此時浸出的蟬花孢子多糖已達到平衡狀態,故酶解時間可采用80 min。由于酶解時間對蟬花孢子粉多糖得率的影響不如其他因素顯著,后續采用Box-Behnken試驗設計進行工藝優化時,不再考察酶解時間對多糖得率的影響。

圖4 酶解時間對蟬花孢子粉多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of CCSP

2.1.5 酶解溫度對多糖得率的影響 不同酶解溫度對酶輔助提取蟬花孢子粉多糖得率的影響如圖5所示。酶解溫度在30～50 ℃時,多糖得率呈顯著(P<0.05)增加的趨勢,這是因為隨著酶解溫度增高,越接近酶的最適溫度,同時浸提體系的黏度降低,有助于多糖分子的浸出。但溫度大于50 ℃后,酶活受到抑制,多糖得率急劇下降。故選取50 ℃為較為適宜的酶解溫度。

圖5 酶解溫度對蟬花孢子粉多糖得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield of CCSP

2.2 Box-Behnken試驗設計及結果

根據單因素實驗結果可知,液料比、纖維素酶用量、酶解pH和酶解溫度對蟬花孢子粉多糖得率的影響較大,而酶解時間多糖得率的影響相對較小。進一步采用四因素三水平Box-Behnken試驗優化酶輔助提取蟬花孢子粉多糖的工藝參數。

Box-Behnken試驗設計及結果如下表3所示。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment

2.2.1 回歸模型的建立與檢驗 利用Design-Expert軟件對表3數據進行多元非線性回歸分析,得到蟬花孢子粉多糖得率(Y)與4個因素即液料比(A)、纖維素酶用量(B)、酶解pH(C)和酶解溫度(D)的二次多項回歸方程:Y=7.29+0.19A+0.3B+0.054C-0.23D-0.04AB-0.085AC+0.040AD-0.040BC+0.025BD-0.13CD-0.037A2-0.38B2-0.92C2-2.48D2。對該回歸方程進行方差分析,結果見表4。

表4 酶輔助提取蟬花孢子粉多糖的回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance with regression model for enzyme-assisted extraction of CCSP

一次項中,A、B、D對響應值的影響極顯著(P<0.01),C對響應值的影響不顯著(P>0.05);二次項中,B2、C2、D2的對響應值的影響達到極顯著(P<0.01),說明各因素與多糖得率之間存在明顯的二次關系;交互項中,CD對響應值的影響達到顯著水平(P<0.05),表明酶解溫度與酶解pH之間的交互效應對蟬花孢子粉多糖的得率有顯著影響。

2.2.2 交互效應分析 為考察酶解溫度與酶解pH之間的交互效應對蟬花孢子粉多糖得率的影響,可固定其它因素為零水平,由Design Expert軟件繪制得到交互效應的響應面,如圖6所示。響應面坡度越陡峭,表明兩因素間的交互效應對多糖得率的影響越大。當酶解溫度從40 ℃增加到50 ℃,多糖得率隨之增加;酶解溫度超過50 ℃后,多糖得率逐漸下降。酶解pH從5.5增加到6.0,多糖得率隨之增加;酶解pH超過6.0后,多糖得率逐漸降低。因此要獲得較高的多糖得率,酶解溫度應在50 ℃左右,酶解pH應在6.0左右。

圖6 酶解溫度與酶解pH的交互效應 對蟬花孢子粉多糖得率的影響Fig.6 Interactive effect of enzymolysis temperature and enzymolysis pH value on the yield of CCSP

2.2.3 最優提取工藝優化以及驗證試驗 對上述回歸方程求二階偏導,得到纖維素酶輔助提取蟬花孢子粉多糖的最佳工藝參數為料液比34.9 mL/g、纖維素酶用量0.64%、酶解時間80 min、酶解pH5.98、酶解溫度50.06 ℃,在此條件下蟬花孢子粉多糖得率的理論值為7.48%。為便于實際操作,將最佳工藝參數調整為液料比35 mL/g,纖維素酶用量0.64%、酶解時間80 min、酶解pH6.0、酶解溫度50 ℃。在此修正條件下,實測蟬花孢子粉多糖得率為7.46%±0.12%(n=3),與理論值較一致,表明此模型的預測性較好,可用于指導生產實踐。

2.3 蟬花孢子粉多糖對酒精性肝損傷小鼠的保護作用

2.3.1 蟬花孢子粉多糖對小鼠體重與臟器系數的影響 由表5可知,與正常組相比,模型組小鼠體重增加值顯著(P<0.05)下降,肝臟系數和脾臟系數顯著升高(P<0.05)。與模型組小鼠相比,蟬花孢子粉多糖處理組小鼠體重增加值顯著(P<0.05)增加,肝臟系數和脾臟系數顯著(P<0.05)下降;中劑量組和高劑量組小鼠體重增加值、肝臟和脾臟系數與正常組無顯著性差異(P>0.05)。與模型組相比,陽性對照水飛薊賓也能顯著(P<0.05)降低酒精性肝損傷小鼠的肝臟系數和脾臟系數,改善小鼠體重。

2.3.2 蟬花孢子粉多糖對血清ALT和AST活性的影響 如圖7所示,模型組小鼠血清AST和ALT活性極顯著高于正常組(P<0.01),表明酒精暴露導致小鼠肝細胞損傷。與模型小鼠相比,蟬花孢子粉多糖組小鼠血清中的AST和ALT活性極顯著降低(P<0.01)。水飛薊賓也能極顯著降低小鼠血清ALT和AST活性(P<0.01)。

表5 蟬花孢子粉多糖對酒精性肝損傷小鼠體重增加值、肝臟系數和脾臟系數的影響Table 5 Effects of CCSP on increase of body weight and organ index in alcohol-induced liver injury mice

表6 蟬花孢子粉多糖對酒精性肝損傷小鼠肝臟SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量的影響Table 6 Effect of CCSP on liver SOD,CAT,GSH-Px activities and MDA level in alcohol-induced liver injury mice

圖7 蟬花孢子粉多糖對酒精性肝損傷 小鼠血清中ALT和AST活性的影響Fig.7 Effect of polysaccharidesspores of Cordyceps cicadae on serum ALT and AST activities in alcohol-inducedliver injury mice注:**P<0.01,與模型組比較極顯著; # #P<0.01,與正常組比較極顯著。

2.3.3 蟬花孢子粉多糖對肝組織中抗氧化酶和MDA含量的影響 如表6所示,模型組小鼠肝臟SOD、CAT和GSH-Px活性均顯著低于正常組(P<0.05),MDA含量顯著高于正常組(P<0.05),提示酒精暴露損傷了機體抗氧化防御體系。蟬花多糖低、中、高劑量組小鼠肝臟中SOD、CAT和GSH-Px活性均顯著高于模型組(P<0.05),MDA含量顯著低于模型組(P<0.05)。陽性對照組小鼠抗氧化酶含量也顯著高于模型組(P<0.05),MDA水平顯著低于模型組(P<0.05)。

3 討論與結論

酶輔助提取技術具有提取得率高、提取條件溫和短等優點,現已應用于多種生物活性多糖的提取中。Li等[19]獲得了酶輔助提取石榴皮多糖的最佳工藝條件為酶解溫度55 ℃,酶解pH5.0,酶解時間88 min,液料比 22∶1 mL/g,纖維素酶用量0.93%。Wu等[20]獲得了復合酶輔助提取竹蓀多糖的最佳工藝參數為纖維素酶用量2.0%,木瓜蛋白酶用量2.0%,果膠酶用量1.5%,酶解溫度52.5 ℃,酶解時間105 min,酶解pH5.25。Rostami等[21]獲得了酶輔助提取歐錦葵多糖的最佳提取條件為纖維素酶用量5.64%,酶解溫度55.65 ℃,酶解時間3.4 h,酶解pH5.22。本研究獲得的纖維素酶輔助提取蟬花孢子粉多糖的最佳工藝參數為液料比35 mL/g,纖維素酶用量0.64%、酶解時間80 min、酶解pH6、酶解溫度50 ℃。不同研究者所得的最佳工藝參數差異較大,這可能與原材料的種類、原材料的粉碎程度、多糖在細胞內的存在位置等因素有關。

肝脾腫大是酒精性肝損傷臨床上最為常見的體征,肝臟系數和脾臟系數可反映肝脾腫大的程度。蟬花孢子粉多糖可明顯降低酒精性肝損傷小鼠的肝臟系數和脾臟系數,提示蟬花孢子粉多糖可緩解酒精攝入造成的肝脾腫大。

肝臟是酒精代謝的主要場所,酒精代謝過程中會產生大量的活性氧,導致肝臟發生氧化應激,造成肝細胞膜損傷,致使血清AST和ALT活性升高。血清AST和ALT活性通常被認為是肝細胞損傷的生物標志物[22-23]。低、中和高劑量蟬花孢子粉多糖均能顯著(P<0.05)拮抗急性酒精誘導的小鼠血清ALT和AST活性升高,提示蟬花孢子粉多糖可能通過維持肝細胞膜通透性,從而發揮其對急性酒精性肝損傷小鼠的保護作用,這與前人研究結果一致[24-26]。

機體抗氧化防御體系分為兩類,即酶促抗氧化體系和非酶促抗氧化體系;酶促抗氧化體系主要由SOD、CAT和GSH-Px等組成[27];MDA是脂質過氧化的終產物,可反映機體氧化損傷的程度[28-29]。乙醇代謝過程中產生的大量活性氧可使SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶蛋白結構發生變化,改變其空間構象,從而使酶活性下降;攻擊細胞內的生物大分子,引起脂質氧化損傷等。蟬花孢子粉多糖能顯著(P<0.05)提高小鼠肝組織中抗氧化酶活性,降低MDA含量,提示蟬花孢子粉多糖可通過提高機體抗氧化酶活性,發揮其對酒精性肝損傷小鼠的保護作用。

本研究通過單因素實驗和響應面法優化得到了纖維素酶輔助提取蟬花孢子粉多糖的最佳工藝參數為液料比35 mL/g,纖維素酶用量0.64%、酶解時間80 min、酶解pH6、酶解溫度50 ℃。在此條件下,蟬花孢子粉多糖得率為7.46%±0.12%。

蟬花孢子粉多糖能降低酒精性肝損傷小鼠血清ALT和AST活性,拮抗酒精所致小鼠肝臟SOD、CAT和GSH-Px活性的下降,降低MDA含量。結果表明蟬花孢子粉多糖對酒精致急性肝損傷小鼠具有較好保護作用,其作用機制與提高機體SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶活性相關。