不同聚合度原花青素分離制備的研究進展

徐佳慧,陳明舜,陳 軍,張成浩,李 信,李 俶

(南昌大學食品學院,江西南昌 330000)

目前國內外提取原花青素的方法主要有溶劑萃取[10]、超臨界流體萃取[11]、微波輔助萃取[12]、超聲波輔助萃取[13]以及酶解法[14]等。原花青素粗提物中含有很多雜質,需進一步分離才能得到純度較高的產品。目前分離純化方法主要有溶劑萃取分離法、層析法[15]、吸附法[16]等。而一般來說,原花青素的分級方法可分為兩類:第一類是液-固色譜法,包括正相液相色譜、反相液相色譜、凝膠過濾色譜和親水相互作用色譜等;第二類是液-液色譜法,包括離心分離色譜、高速逆流色譜和漸進溶劑沉淀法等[17]。另外,常用紫外分光光度法、香草醛檢測法、鉬酸銨分光光度法、鐵鹽催化比色法和高效液相色譜法等來測定原花青素含量[18]。通過分析產物的紫外吸收光譜、質譜以及核磁共振譜鑒定并確認其組成單元,再計算出原花青素的平均聚合度。

本文將從液-固色譜法和液-液色譜法這兩類方法的角度綜述常見的不同聚合度原花青素的制備方式,以期為更好地制備不同聚合度的原花青素提供理論依據和指導,為進一步研究原花青素聚合度與其生理活性的相關性創造可能性。

1 液-固色譜法制備原花青素

液-固色譜法是以固體吸附劑為固定相,液體為流動相的常見分離方法,其分離原理是根據吸附于固定相中的各組分在液體流動相中分配系數的不同,最終固液相對平衡而達到分離目的[19]。在正相色譜柱中,原花青素按其聚合度洗脫,硅膠珠常作為柱材。然而,在反相色譜柱中,原花青素按其極性洗脫,具有相同聚合度的原花青素同分異構體之間可能具有不同的保留時間[20]。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法,常用的柱材有大孔吸附樹脂、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20、Toyopearl HW-40等,由于其柱材相對易得、裝柱簡單、使用方便、對高分子物質分離效果好,因此目前應用最為廣泛[21-22]。

1.1 高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)

研究表明,利用HPLC分級制備不同聚合度的原花青素,其原理是原花青素聚合度越高,活性酚羥基數量越少,分子極性越小,在非極性色譜柱上吸附得越緊密,流動相較難洗脫,樣品出峰時間晚[23]。由于該方法進樣量少,可以測定一定聚合度范圍內原花青素含量,因此其在原花青素分級中多用于定性、定量分析。該方法的不足之處在于原花青素成分具有復雜性,同時受到對照品和分析手段的限制,目前還不能把其中的每一個成分單獨分離出來,只能得到一定聚合度范圍內的原花青素,因此,在分級前應對樣品進行預處理,如利用硅膠柱層析、Sephadex LH-20、Sephadex G25、Toyopeah TSK HW40等柱層析方法或者薄層層析法,以免影響分級效果[24-25]。

1.2 大孔吸附樹脂法

大孔吸附樹脂法具有選擇性優良、進樣量大、重復使用方便及理化性質穩定等優點,在天然物質分離純化中得到較多的研究和應用。利用大孔吸附樹脂法分級原花青素的原理是原花青素的聚合度越高,單位質量的原花青素所具有的活性酚羥基數量越少,極性越小,分子的親水性減弱[26]。同時,原花青素聚合度越高,分子空間構象越復雜,分子體積增大,與樹脂之間的作用點增多,需要更高濃度的乙醇溶液才能洗脫[27]。

姜倩等[28]采用AB-8大孔吸附樹脂分離肉桂原花青素,用體積分數分別為10%、50%、70%、100%的乙醇溶液洗脫,結果發現,隨著乙醇體積分數的增大,其洗脫液中原花青素的聚合度越高,另外,10%乙醇洗脫液中原花青素的抗氧化活性最強,對DPPH·的清除率為0.91 g/L。朱靖蓉等[29]對比了AB-8、ADS-8和S-8型三種大孔吸附樹脂對原花青素分離純化的效果,結果表明,ADS-8大孔吸附樹脂對葡萄籽原花青素吸附能力最強,產物純度大于95%,分離效果最好。白歡歡等[30]利用AB-8大孔吸附樹脂分離花生紅衣原花青素,結果發現體積分數為20%和40%的乙醇溶液洗脫得到的產物均為低聚原花青素,且均為A型原花青素。

另外,也有較多研究通過大孔吸附樹脂法與其他分離方法相結合的方式對原花青素進行分離或分級。Sui等[31]通過AB-8柱層析和Toyopearl HW-40柱層析相結合制備荔枝皮中(-)-兒茶素和寡聚原花青素,結果表明表兒茶素和A型原花青素三聚體的產率最高。Dong等[32]以花生皮和柿子單寧裂解產物為原料,先后用AB-8柱層析、Toyopearl HW-40柱層析進行洗脫,結果顯示二者所制備的A型原花青素寡聚體含量均較高。進一步地,在體內和體外實驗中,發現A型和B型二聚體均具有較高的抗氧化能力,且呈劑量依賴性,一般情況下,B型二聚體相比于具有相同亞基的A型二聚體有更高的自由基清除能力,但在組織或脂質系統中,A型二聚體與B型二聚體具有相似的抗氧化能力。大孔吸附樹脂法常用來分離制備A型低聚原花青素,分離效果較好,應用廣泛,但其吸附效果易受樣品流速和溶質濃度的影響,所得產物純度較低,在多種分離技術相結合的分級方式中,大孔吸附樹脂法常用作進一步純化和初步分離。

1.3 葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱分離法

Sephadex LH-20是一種常用的葡聚糖凝膠填料,具有使用簡便、產物純度高、適用范圍廣等優點[33]。Sephadex LH-20的分級原理是在Sephadex LH-20柱中,組分極性越大,保留能力越弱,最先被洗脫,而原花青素隨著聚合度的增高,分子極性降低,因此低聚合度的原花青素先出柱,Sephadex LH-20柱能起到分配色譜的作用[34]。

Sephadex LH-20柱分離法是近幾年用于原花青素分離分級較多的方法。雷斗劍[35]利用Sephadex LH-20對火棘果原花青素提取物進行分離,得到8種具有不同聚合度的原花青素組分,其聚合度范圍為5～16。Ling等[36]用Me2CO/H2O(7∶3)萃取蓮子房原花青素,后用Sephadex LH-20柱層析進行分離,得到的產物純度大于98%,質譜分析表明,該產物為原花青素單倍體、二聚體和四聚體的混合物,其中二聚體的含量最高。通過抑制脂氧合酶活性和對自由基清除率影響的實驗發現,0.1%的蓮子房原花青素產物在大豆油體系中具有較強的抗氧化活性,在相同濃度下優于二丁基羥基甲苯。Fu等[37]從山竹果果皮中提取低聚原花青素,用Sephadex LH-20柱分離得到0.66%的產率(干物質),且分離出的原花青素具有較強的過氧自由基清除能力,其清除能力為1.7×104μmol TE/g。Gong等[38]經兩輪Sephadex LH-20柱層析分餾荔枝果皮得到S3片段,其進一步分離得到四種不同的A型或B型表兒茶素低聚物,經實驗發現,這些低聚物的抗氧化活性和對人肺癌細胞A549增殖的抑制作用均強于荔枝花青素。馬燁[39]用Sephadex LH-20柱分離純化后的紅米原花青素,得到平均聚合度為4.14的六個原花青素組分,進一步研究發現,平均聚合度在2.8～8.6范圍內的前五個紅米原花青素組分抗氧化活性與聚合度呈正相關,但平均聚合度為12.7的最后一個組分抗氧化活性顯著降低。

另外,也有較多研究通過Sephadex LH-20柱分離法與其他分離方法相結合的方式對原花青素進行分離或分級。李倩[40]利用大孔吸附樹脂對南酸棗皮原花青素提取物進行初純化,再利用不同濃度甲醇溶液,通過葡聚糖凝膠LH-20層析柱對南酸棗皮原花青素提取物進行純化分級,得到的五個原花青素組分平均聚合度為1.9～9.3。進一步研究發現,隨著原花青素組分平均聚合度的增加,其對結腸癌細胞增殖和對α-淀粉酶、α-葡糖苷酶的抑制作用隨之增強,但抗氧化活性隨之減弱,這可能是由于分子量大的原花青素,不易穿過細胞膜進入細胞內發揮抗氧化作用。周蒙等[41]通過葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱和快速蛋白液相色譜分離純化黑荊樹粗提物,得到純度大于90%、得率大于13%的黑荊樹原花色素二聚體,進一步研究發現,該原花色素二聚體的抗氧化活性高于原花青素單體標樣。Wiesneth等[42]將LH-20、MCI-、Diol-和RP-18-phases色譜聯合分離沙柳粗提物,制得原花青素B1、B2、B3、B4、C1、表兒茶素-(4β→8)-表兒茶素-(4β→8)-兒茶素和表兒茶素-(4β→8)-表兒茶素-(4β→8)-表兒茶素-(4β→8)-兒茶素等化合物。Hellenbrand等[43]開發了一種將Sephadex LH-20層析與制備高效液相色譜相結合的方式,對貫葉連翹中的金絲桃的丙酮-水提取物進行分級,得到聚合度從3到10的原花青素。Ito等[44]采用Sephadex LH-20柱層析和反相制備高效液相色譜法,從黑豆種皮中分離出原花青素低聚物(二聚物到四聚物)。Lepp?等[45]采用Sephadex LH-20柱層析法與半制備液相色譜相結合的方式,可控制性地從11種不同植物中分離出幾十個化學和色譜良好的PC組分。綜上所述,Sephadex LH-20柱分離法分級效果好,可分離低聚和高聚原花青素,但價格偏貴。

1.4 Toyopearl HW-40柱分離法

Toyopearl HW-40和Sephadex LH-20柱分離法一樣,也是一種常見的尺寸排阻色譜,在原花青素的分級中發揮著分子篩的作用,分級后所得產物純度較高。Toyopearl HW-40由乙烯醇和甲基丙烯酸酯共聚而成的半堅硬的球狀體組成,相對而言,Sephadex LH-20柱價格更高,分級效果更好,很少研究報道單獨使用Toyopearl HW-40柱進行分級。但二者尺寸不同,Toyopearl HW-40孔徑更小,是脫鹽的理想選擇,而Sephadex LH-20適用于天然產物在有機溶劑中的純化。Toyopearl HW-40對原花青素的分級原理是Toyopearl HW-40表面的-OH具有親水性,能吸附較多親水性官能團[46]。不同聚合度的原花青素具有不同的分子量,而Toyopearl HW-40柱起到了分子篩的作用。Rosales-Castro等[47]用乙酸乙酯對西葫蘆樹皮粗提取物進行液體分配,得到有機提取物,然后用柱層析法(Toyopearl HW-40F)分級,在產物中檢測、鑒定出了聚合度分別為2、3、4的低聚原花青素,并通過測定發現這些低聚物具備較高的抗自由基活性。Rosales-Castro等[48]用相似的方法從杜鵑櫟樹皮中分離出低聚原花青素,均表現出最佳的抗氧化能力。

目前相對常見的是將Toyopearl HW-40柱分離法與其他分離方法相結合的方式對原花青素進行分級。Kawahara等[49]用Amberlite XAD-1180N、Toyopearl HW40F和Sepacore C-18反相色譜柱相結合的方式將紅小豆中的原花青素濃縮成5個餾分,并鑒定這些組分分別為(表)兒茶素六聚物、七聚物和八聚物、沒食子兒茶素-(表)兒茶素五聚物和(表)沒食子兒茶素-(表)兒茶素六聚物。這些組分對人PC-3前列腺癌細胞具有顯著的抗癌活性,它們還能顯著抑制脂肪酸結合蛋白基因的表達,該基因在前列腺癌細胞的生長和轉移中起重要作用。Sei-ichi等[50]采用相似的方法得出了相近的結果,其利用Amberlite XAD-1180N、Sephadex-LH-20、Toyopearl HW-40F和反相高效液相色譜對葡萄莖提取物中原花青素組分進行了純化,并測定了兩種關鍵化合物為沒食子兒茶素-(表兒茶素)7沒食子酸鹽。其中沒食子兒茶素-(表兒茶素)7沒食子酸酯(化合物1)在PC-3前列腺癌細胞中具有顯著的抗癌活性。周瑋婧等[51]將荔枝皮原花青素浸提物通過AB-8大孔樹脂純化,并進一步通過Toyopearl HW-40S樹脂層析分級處理,得到荔枝皮原花青素低聚體,其主要成分為(-)-表兒茶素、A型原花青素二聚體和A型原花青素三聚體。Schmidt等[52]以野藍莓為原料,分別采用Toyopearl和Sephadex LH-20柱層析法,采用液體真空法和開放柱層析法將其分離為富含原花青素的組分,得到的兩個原花青素組分平均聚合度為3.25和5.65,均能抑制引起尿路感染的大腸桿菌的粘附。另外,只有聚合度為5.65的部分對人前列腺和小鼠肝癌細胞系有明顯的抗增殖活性。Xiao等[53]將澳洲青蘋果(Granny Smith apples,GSE)粗提物通過ADS-17大孔樹脂柱純化,得到了該蘋果的原花青素提取物,并進一步在Toyopearl TSK HW-40s柱上,按聚合度對GSE進行了分級,得到原花青素B2和C1。利用Toyopearl HW-40柱分離法與其他分離方法相結合的方式對原花青素進行分級,所得原花青素產物純度更高,分級效果更理想。

2 液-液色譜法制備原花青素

液-液色譜法是流動相和固定相均為液體的分離方法,它依賴于PC在不同溶劑體系中分配系數的不同,常需要與液-固色譜法相結合來檢測目標物質,是目前分離分級原花青素較新的方法。

2.1 高速逆流色譜法(High-speed Countercurrent Chromatography,HSCCC)

高速逆流色譜法利用了一種特殊的流體動力學(單向流體動力學平衡)現象,使兩個互不相溶的溶劑體系在高速旋轉的螺旋管中單向分布,從而實現不同溶解分配系數的溶質在兩相溶劑中的高效分離[54-55]。Shibusawa等[56]用HSCCC法以乙酸甲酯-水為1∶1的兩相溶劑體系,1.0 mL/min的洗脫速率從蘋果中分離原花青素,對各組分進行飛行時間質譜分析,發現原花青素按聚合度進行分離,聚合度在5～13的原花青素含量最多,其次是原花青素單體,包括(+)兒茶素和(-)表兒茶素。Esatbeyoglu等[57]利用高速逆流色譜(HSCCC)成功從野櫻桃中分離出半合成反應混合物,并發現HSCCC可在制備規模上分離純原花青素B1[(-)-表兒茶素-4β→8-(+)-兒茶素]、B2[(-)-表兒茶素-4β→8-(-)-表兒茶素]、B5[(-)-表兒茶素-4β→6-(-)-表兒茶素]和B7[(-)-表兒茶素-4β→6-(+)-兒茶素]。Esatbeyoglu等[58]首次報道了利用高速逆流色譜法與其他逆流色譜法相結合的方式從可可豆中分離并半合成二聚到五聚的原花青素。Zhang等[59]報道在優化的HSCCC條件下,葡萄籽原花青素可被分離為7個不同的組分,平均聚合度范圍為1.5～6.9,且原花青素抗氧化活性與DP值呈負相關。Li等[60]用高速逆流色譜法對可可豆中原花青素進行分級,餾分中原花青素聚合度范圍為1～5,二聚原花青素B2純度超過86%。通過抗氧化活性測定,發現原花青素的抗氧化活性隨著其聚合度的增加而降低。Peng等[61]通過實驗也發現,與以往方法相比,HSCCC在制備二聚原花青素方面具有一定的優勢。Luo等[62]采用HSCCC和prep-HPLC對葡萄籽亞硫酸降解產物進行分級,共獲得10種二聚和三聚原花青素,其純度和產率均較高。Bai等[63]采用高速逆流色譜法從葡萄籽高聚原花青素半合成產物中分離出三個餾分,并使用制備型HPLC分離出各個原花青素,獲得了13種B型原花青素,包括單體、二聚體和三聚體,其純度超過91%。

Kumar等[64]以新鮮茶樹葉片為原料,經Sephadex LH-20層析和高速逆流層析得到含有四聚A型和B型原花青素組分。高速逆流色譜法應用相對較多,其分級原花青素制得的產物純度和產率都較高,但其解吸率低,作為一種相對較新的分離純化技術,仍有許多理論和實踐問題需要解決,另外,尚缺乏完善的設備條件,制備規模受到限制,不適合大規模生產。

2.2 漸進溶劑沉淀法

漸進溶劑沉淀法是指非極性的低分子烷烴溶劑對減壓渣油中的各組分具有不同的溶解度,利用溶解度的差異可以實現組分分離。Yang等[17]用漸進溶劑沉淀從芒果果皮中制備寡聚原花青素,并對其進行分餾。研究結果發現漸進溶劑沉淀法可以直接純化聚合度值接近1的寡聚物。趙丹等[65]以葡萄皮原花青素為原料,采用漸進溶劑沉淀法對其進行分級處理,通過測定后發現隨著聚合度的增加,其抗氧化能力下降。漸進溶劑沉淀法分級效果好,且不存在吸附損失,但操作復雜,應用較少。

3 結論

原花青素的生理活性與其聚合度、羥基的數量及位置、單體的連接方式和空間構型等息息相關,分離和制備不同聚合度的原花青素一直以來是研究的熱點[66]。總結之前的研究可以發現:

許多不同的分離方法已被用于原花青素的分級,每種分離方法各有優劣。

相比于高聚合度的原花青素,低聚原花青素的分級制備更受關注。這可能是因為植物體內的原花青素常以高聚形式存在,分級制備高聚原花青素相對簡單。更重要的是,高聚原花青素的分子量較大,受空間位阻影響,酚羥基活性受到影響。

目前對原花青素的分級很少采用單一的分離方式,在原花青素的分級中,常見的方法是連續采用多種液-固色譜法,或者是采用液-固色譜法和液-液色譜法相結合的方式[67]。這是因為采用單一的分離方式,分級效果不理想,所得分級產物聚合度不集中,純度較低。采用多種分離方法相結合的方式能最大程度發揮每一種方法的作用,達到進一步純化或細分的目的。

在分級制備得到不同聚合度的原花青素之后,有部分文獻報道了繼續測定不同聚合度原花青素的生理活性,但絕大多數局限于測定不同聚合度原花青素的抗氧化和抗癌活性。一般而言,原花青素聚合度越高,抗氧化活性越低,而抗癌活性隨之增強,這可能與原花青素羥基的數量和位置以及空間構型有關。

雖然目前對原花青素進行分級的研究較多,但是鮮有研究報道能夠分離制備出具有單一聚合度純度較高的原花青素,這仍然是目前研究的難點,且原花青素與聚合度的構效關系尚不明確。未來可以從以下方面進行深入研究:

每種分離方法在分級制備不同聚合度的原花青素中各有優劣,綜合考慮各種方法,揚長避短,優化分級方式,以期達到最佳分級效果。

制備純度較高的單一聚合度的原花青素,在此基礎上研究原花青素的抗氧化、抗癌、降血壓、免疫調節等生理活性與其聚合度的關系,明確原花青素與聚合度的構效關系,以期提高原花青素的利用率。