SKA3促進子宮內膜癌細胞增殖、遷移和侵襲

丁紅巖，徐洪閣，張 磊，韓亞青

南京醫科大學附屬淮安市第一人民醫院 婦科(淮安 223300)

子宮內膜癌的病死率約20%，每年有近20萬的新發病例，全世界每年約有74 000例死亡[1]。在過去的20年中，子宮內膜癌的發病率增加了21%，病死率增加了100%以上[2]。紡錘體與著絲粒相關蛋白3(SKA3)位于第13q號染色體上，與紡錘體和著絲粒有關，它不僅能調節NDC80復合體的有絲分裂，還會調控細胞增殖和凋亡。有研究[3]表明，SKA3參與多種癌癥的發生與發展，且在肝癌中高表達，可促進肝癌細胞增殖。而磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶(AKT)信號通路的改變可影響腫瘤的發生和發展。本研究旨在研究SKA3在子宮內膜癌中的作用與機制，為治療子宮內膜癌尋找有效的新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

脂質體2000(Invitrogen公司，美國)；siRNA-SKA3、NC(廣州銳博生物科技公司)；所有引物(上海生工生物工程公司)；Trizol試劑盒、SYBR一步法熒光定量PCR試劑盒(北京安諾倫生物科技有限公司)；10%胎牛血清、達爾貝科極限必需培養液(Dulbecco minimum essential medium,DMEM)、無血清RPMI-1640培養、含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基(Gibco公司，美國)；子宮內膜上皮細胞HEECs、子宮內膜癌細胞KLE、JEC、Ishikawa細胞(中國科學院上海生科院細胞資源中心)；Transwell(8 μm)小室(Millipore公司，美國)；CCK8試劑(上海東仁化學公司)；細胞裂解液(上海碧云天公司)；SKA3兔多克隆抗體(ab186003)、β-actin兔單克隆抗體(ab115777)、山羊抗兔IgG二抗(ab6721，上海艾博抗貿易有限公司)；CyclinD1兔單克隆抗體(IMG-80118，Imgenex公司，美國)；MMP-2兔單克隆抗體(AF1420)、AKT兔多克隆抗體(AA326-1，上海碧云天公司)；p-AKT兔單克隆抗體(44-621G，Thermo Fisher公司，美國)。

Bio-Rad CFX Manager3.1軟件(BD Biosciences公司，美國)；酶標儀(上海赫冠公司)；培養箱、化學發光成像儀(Thermo Fisher公司，美國)；高壓滅菌鍋(青島海爾生物醫療公司)。

1.2 RT-qPCR和蛋白質印跡技術檢測SKA3 mRNA和蛋白表達水平

使用Trizol試劑盒提取細胞(子宮內膜上皮細胞HEECs、子宮內膜癌細胞KLE、JEC、Ishikawa細胞)的總RNA。將RNA模板、引物、2×UltraSYBR One Step RT-qPCR Buffe(r+With+ROX)、SuperEnzyme Mix和RNase-Free Water溶解并置于冰上備用。根據SYBR一步法熒光定量PCR試劑盒說明書，配制RT-qPCR反應體系，按以下反應條件進行反應。逆轉錄45 ℃ 10 min，預變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 2 min，循環35次。使用Bio-Rad CFX Manager 3.1軟件進行分析，重復實驗3次，以β-actin作為內參基因，采用2-△Ct的方法進行相對定量分析，引物如下(表1)。

表1 RT-qPCR引物

將子宮內膜上皮細胞HEECs和子宮內膜癌細胞KLE、JEC、Ishikawa細胞在裂解液中裂解，超聲處理后4 ℃下以離心半徑6.5 cm，轉速14 000 r/min離心15 min，收集上清液(組織裂解物)。取30 μg蛋白質樣品并通過10%SDS-PAGE電泳，轉移到聚偏二氟乙烯膜上，用TBST配置的5%脫脂奶封閉1 h。將聚偏二氟乙烯膜與SKA3抗體(1∶2 000)、β-actin(1∶200)中4 ℃孵育過夜。第2天復溫1 h后TBST洗滌3次，與山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)孵育抗體1 h。漂洗后用超敏ECL化學發光試劑在化學發光成像儀內顯影。使用GeneTools軟件對免疫印跡圖像進行定量，重復實驗3次。

1.3 細胞培養與轉染

所有細胞均在37 ℃ 5%CO2中的10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的達爾貝科極限必需培養液(Dulbecco minimum essential medium,DMEM)培養基中培養。轉染時，將Ishikawa細胞以6×104個/孔的密度接種到12孔組織培養板中，在培養液中培養24 h。對照組：正常培養Ishikawa細胞；si-SKA3組：根據脂質體2000說明書，將50 nmol/L siRNA-SKA3轉染至Ishikawa細胞；NC組：根據脂質體2000說明書，將50 nmol/L siRNA-NC轉染至Ishikawa細胞。37 ℃、5%CO2條件下繼續培養48 h后進行后續實驗。

1.4 CCK8和克隆形成實驗檢測細胞增殖情況

在96孔板中接種各組細胞懸液(2×104個/mL，100 μL/孔)，將培養板放在培養箱中預培養一段時間(37 ℃，5% CO2)。每孔加入10 μL CCK8試劑，在培養箱內孵育2 h。在24、48、72、96 h用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值，繪制細胞增殖曲線,重復實驗3次。取各組對數生長期的細胞，制備細胞懸液(2×104個/mL)，梯度倍數稀釋后分別接種于含培養液的皿中，培養2周。棄上清液后用4%多聚甲醛固定，GIMSA染色液染20 min。根據公式計算克隆形成率。重復實驗3次。

1.5 Transwell和劃痕實驗檢測細胞侵襲和遷移情況

在Transwell上室加入250 μL的無血清培養基，室溫下靜置20 min。取無血清RPMI-1640培養的濃度為5×104個/mL的各組細胞懸液200 μL加置Transwell小室。下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基。24 h后棄去孔中培養液，無鈣的磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次后加入甲醇固定30 min，將小室適當風干。結晶紫染色后擦掉上層未遷移細胞，磷酸緩沖鹽溶液漂洗3次。在顯微鏡下觀察細胞并記數。重復實驗3次。

將與實驗相關的器械進行高溫和紫外線滅菌后開始實驗。先在6孔板背后均勻地劃橫線，約隔0.5～1.0 cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。在空中加入約5×105個細胞，第2天用槍頭比著直尺，垂直于橫線劃線。磷酸緩沖鹽溶液漂洗3次，加入無血清的培養基后置于培養箱培養。第0、24 h從培養皿中取樣，進行觀察與拍照。重復實驗3次。

1.6 蛋白質印跡技術檢測CyclinD1、MMP-2、AKT、p-AKT蛋白表達水平

各組細胞裂解后，10%SDS-PAGE進行電泳，轉膜后進行封閉。加入CyclinD1(1∶2 000)、MMP-2(1∶1 000)、AKT(1∶3 000)、p-AKT(1∶2 000)、β-actin(1∶2 000)在4 ℃下孵育過夜。第2天室溫復溫，漂洗后加入山羊抗兔IgG二抗(1：10 000)進行二抗孵育，在化學發光成像儀內顯影。重復實驗3次。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 SKA3在各細胞系中的表達

與子宮內膜上皮細胞HEECs比，SKA3 mRNA和蛋白在子宮內膜癌細胞KLE、JEC、Ishikawa細胞中的表達量升高(F=206.926、541.391；P均<0.001)(圖1、表2)。選取相對表達量最高的Ishikawa細胞作為研究對象，對其進行轉染，與對照組和NC組比，si-SKA3組SKA3 mRNA表達水平下降(F=205.138，P<0.001)，提示轉染效果佳(圖2、表3)。

圖1 SKA3在各細胞系中的表達

表2 各細胞系SKA3 mRNA和蛋白表達

圖2 轉染后各組細胞SKA3 mRNA表達量

表3 轉染后各組細胞SKA3 mRNA表達量(n=3)

2.2 SKA3對各組細胞增殖的影響

CCK8實驗結果顯示，與對照組和NC組比，si-SKA3組細胞增殖能力在48、72、96 h受到明顯抑制(F=35.131，P<0.001;F=19.400，P=0.002；F=31.457,P=0.001)。克隆形成實驗結果顯示，與對照組和NC組比，si-SKA3組細胞數目減少(F=76.651，P<0.001)。蛋白質印跡技術實驗結果顯示，與對照組和NC組比，si-SKA3組CyclinD1蛋白表達量明顯下降(F=323.641，P<0.001)(圖3、表4)。

圖3 SKA3對各組細胞增殖情況的影響

表4 SKA3對各組細胞克隆和CyclinD1蛋白表達量的影響

2.3 SKA3對各組細胞侵襲和遷移的影響

Transwell實驗結果顯示，與對照組和NC組比，si-SKA3組細胞穿膜數明顯下降，差異有統計學意義(F=28.720，P=0.001)。劃痕實驗結果顯示，與對照組和NC組比，si-SKA3組劃痕寬度明顯增大(F=71.590，P<0.001)。蛋白質印跡技術結果顯示，與對照組和NC組比，si-SKA3組細胞MMP-2蛋白表達量明顯下降，差異有統計學意義(F=77.932，P<0.001)(圖4、表5)。

圖4 SKA3對各組細胞侵襲和遷移的影響

表5 SKA3對各組細胞侵襲和遷移的影響

2.4 SKA3對PI3K/AKT信號通路的影響

蛋白質印跡技術實驗結果顯示，si-SKA3組與對照組和NC組比，細胞中AKT蛋白表達量差異無統計學意義(F=1.091，P=0.394)，p-AKT蛋白表達量明顯下降(F=226.891，P<0.001)(圖5、表6)。

圖5 SKA3對PI3K/AKT信號通路的影響

表6 SKA3對各組細胞AKT、p-AKT蛋白表達量的影響

3 討論

子宮內膜癌是女性生殖器的三大惡性腫瘤之一，是占女性全身惡性腫瘤的7%和女性生殖器惡性腫瘤的20%～30%。其中，被診斷為子宮內膜癌的婦女中約有67%處于早期階段，約21%局部擴散至盆腔淋巴結和周圍器官，約8%發生轉移，其死亡的主要原因與腫瘤的侵襲和轉移明顯相關[4-5]。

SKA3是一種紡錘體和線粒體相關的復雜亞基，是減數分裂紡錘體遷移和后期紡錘體穩定性的關鍵，且參與促進癌癥的惡性轉化，如SKA3促進乳腺癌細胞生長[6]。而過表達SKA3與多種腫瘤的發生與發展密切相關，Hou等[7]研究發現，SKA3在肝癌組織和肝癌細胞中的表達水平高于正常肝組織和正常細胞；且過表達SKA3肝癌細胞的增殖明顯增強，而干擾SKA3表達后肝癌細胞的增殖顯著減弱，SKA3可促進肝癌細胞的增殖，減少肝癌細胞的凋亡。Chuang等[8]發現，過表達SKA3導致結直腸腺瘤癌變，而敲除結直腸腺瘤細胞中的SKA3會大大降低細胞生長速率，誘導G2/M阻滯并減少細胞遷移和侵襲。

周期蛋白D1(CyclinD1)是高度保守的細胞周期蛋白家族的成員之一，通過抑制細胞周期來控制細胞周期G1/S的轉變。研究[9]表明，CyclinD1可與核受體結合以促進某些類型細胞的增殖，并與組蛋白乙酰化酶和脫乙酰基酶結合以表觀遺傳地調控基因表達。另外，CyclinD1過表達會使基因突變、擴增和重排，從而導致不同類型的惡性腫瘤。Liao等[10]研究發現，子宮內膜癌細胞中CyclinD1的表達上調。但是，目前還不清楚CyclinD1是否以及如何調節子宮內膜癌的表達。而基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)是鋅依賴性金屬蛋白酶基因家族的成員，在癌癥的侵襲，轉移和進展中起著至關重要的作用。Liu等[11]發現，在子宮內膜癌中MMP-2高表達，且與子宮內膜癌細胞的侵襲有關。Hu等[12]發現，SKA3可通過PI3K/AKT依賴性方式增加MMP-2的表達，促進肺腺癌細胞的遷移與侵襲能力。本研究發現，子宮內膜癌細胞系的SKA3 mRNA和蛋白表達水平較高，而干擾SKA3表達后，細胞的增殖、侵襲能力降低，劃痕寬度變大，CyclinD1和MMP-2蛋白表達量均明顯下降，這表明干擾SKA3能夠抑制子宮內膜癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

PI3K/AKT信號傳導途徑通過激活下游相應的效應子分子參與多種細胞生理過程的調控，在細胞周期，生長和增殖中起著重要作用。有研究[13]表明，該信號通路與子宮內膜癌關系密切。Chen等[14]發現，組蛋白賴氨酸特異性脫甲基酶1通過影響PI3K/AKT信號抑制子宮內膜癌細胞的增殖。另外，也有研究[15]表明，該信號通路與SKA3也有緊密聯系，SKA3過表達通過促進細胞周期進程和激活PI3K/AKT信號通路來促進宮頸癌細胞的增殖與遷移。本研究發現，si-SKA3組細胞AKT蛋白表達無明顯變化，但p-AKT蛋白表達下降，提示SKA3可能通過抑制PI3K/AKT信號通路促進子宮內膜癌細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，干擾SKA3可能通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制子宮內膜癌細胞增殖、遷移和侵襲，表明干擾SKA3可能是治療子宮內膜癌新的治療選擇。