肝素在抗腫瘤藥物遞送系統(tǒng)中的應(yīng)用

臧 靖， 柯 學(xué)， 慈天元,2

（1. 中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 210009；2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203）

肝素是由高度硫酸化的糖醛酸及葡萄糖胺交替排列組成的天然多糖[1]。1916年肝素在約翰霍普金斯醫(yī)院首次被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)科學(xué)家認(rèn)為這種強(qiáng)抗凝類(lèi)物質(zhì)僅存在于肝臟，故將其命名為肝素[2]。肝素在體內(nèi)多存在于肥大細(xì)胞顆粒中，相對(duì)分子質(zhì)量一般為5.0×103至4.0×104[3]。

20世紀(jì)20年代，人們第一次嘗試將肝素應(yīng)用于臨床輸血，但由于當(dāng)時(shí)技術(shù)水平的限制，肝素的粗提取物引發(fā)了嚴(yán)重不良反應(yīng)，臨床使用被迫中斷[4]。1935年，Jorpes研究團(tuán)隊(duì)確定了肝素的基本結(jié)構(gòu)單元，即為交替的糖醛酸和葡萄糖胺基組成的硫酸化二糖，同時(shí)還分離出較高純度的肝素，為肝素的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[5]。1939年，肝素被美國(guó)食品及衛(wèi)生管理局（FDA）批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。

肝素除了作為傳統(tǒng)的抗凝劑外，亦可抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。早在1930年，Takeuchi發(fā)現(xiàn)肝素可以影響移植瘤的生長(zhǎng)[6]，這一研究引發(fā)了科學(xué)家對(duì)肝素在抗腫瘤領(lǐng)域的關(guān)注，并且越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)肝素具有良好的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用[7]。Agostino等[8]在給大鼠靜脈注射Walker 256癌肉瘤細(xì)胞前注射肝素，治療組只有約35 %的大鼠出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，而對(duì)照組有約65 %的大鼠出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。臨床實(shí)驗(yàn)中也觀察到類(lèi)似結(jié)果，Kakkar等[9]在一項(xiàng)對(duì)1250名腫瘤患者進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)，在圍手術(shù)期進(jìn)行肝素治療患者轉(zhuǎn)移性癌癥死亡率為9.2 %，明顯低于未進(jìn)行肝素治療組的死亡率（21.4 %）。然而，研究人員發(fā)現(xiàn)將肝素應(yīng)用于非抗凝領(lǐng)域時(shí)，在使用過(guò)程中存在一定的出血風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重時(shí)可能危及患者生命[10]。為解決這個(gè)問(wèn)題，研究人員對(duì)肝素的抗凝機(jī)制開(kāi)展了大量研究，并在1976年發(fā)現(xiàn)并非肝素分子的所有部分都具有抗凝活性[11]。1978年，出現(xiàn)了低分子量肝素（LMWH）即肝素經(jīng)裂解后得到的分子量較低的肝素衍生物[11]；4年后Kakkar等首次發(fā)表了有關(guān)LMWH的臨床研究[2]。目前，LMWH主要由普通肝素（UFH）經(jīng)過(guò)化學(xué)降解或生物酶解獲得[12]。與UFH相比，LMWH保留了抗血栓功能，但抗凝血作用顯著降低[13]。

隨著對(duì)肝素抗腫瘤轉(zhuǎn)移功能的深入研究，目前已有大量工作報(bào)道了以肝素及其衍生物作為藥物載體在抗腫瘤治療中的意義和優(yōu)勢(shì)，本文基于肝素及其衍生物的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用機(jī)理及肝素在藥物遞送系統(tǒng)中的應(yīng)用，圍繞相關(guān)設(shè)計(jì)思路與方法展開(kāi)綜述，并對(duì)肝素制劑存在的問(wèn)題及未來(lái)研究方向進(jìn)行了討論。圖1示出了肝素的化學(xué)結(jié)構(gòu)、以肝素為基礎(chǔ)的藥物遞送系統(tǒng)以及肝素抗腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)理。

圖1 （a）肝素的化學(xué)結(jié)構(gòu)；（b）以肝素為基礎(chǔ)的藥物遞送系統(tǒng)；（c）肝素抗腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)理Fig. 1 （a）Structure of heparin;（b）Heparin-based drug delivery system;（c）Anti-tumor mechanism of heparin

1 肝素抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用機(jī)理

腫瘤轉(zhuǎn)移是涉及侵襲-轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)的多步驟復(fù)雜過(guò)程，一般包含原發(fā)瘤的生長(zhǎng)、腫瘤新生血管形成、腫瘤細(xì)胞脫落進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)、到達(dá)靶部位形成新轉(zhuǎn)移灶等過(guò)程[14]。肝素抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)理包括：通過(guò)下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)抑制新生血管形成[15]、與硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）競(jìng)爭(zhēng)乙酰肝素酶（HPA）結(jié)合位點(diǎn)抑制胞外基質(zhì)（ECM）與基底膜（BM）的破壞[16]、抑制P-和L-選擇素介導(dǎo)的血小板、白細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的黏附進(jìn)而阻斷腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)[17]、抑制上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[18]等。由于肝素本身對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用有限，常與其他化療藥物聯(lián)用以發(fā)揮抗腫瘤及抗腫瘤轉(zhuǎn)移的功能，實(shí)現(xiàn)“1+1＞2”的治療效果[19]。

1.1 減弱凝血功能

晚期癌癥患者常表現(xiàn)出血液高凝，即腫瘤細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生促凝血蛋白、炎性細(xì)胞因子、黏附分子激活止血系統(tǒng)[20]；同時(shí)，凝血蛋白可直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞來(lái)參與腫瘤生長(zhǎng)的增強(qiáng)[21]。臨床數(shù)據(jù)證明抗凝劑的使用可以減緩癌癥的進(jìn)程，例如在對(duì)小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行放化療的同時(shí)聯(lián)合給予抗凝血藥物華法林鈉可延長(zhǎng)患者的生存期[22]。肝素具有同樣的效果，1994年Lebeau等[23]發(fā)現(xiàn)皮下注射肝素有助于提高小細(xì)胞肺癌患者的生存率。

1.2 抑制新生血管生成

腫瘤新生血管形成是腫瘤組織生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的必要條件。1971年美國(guó)科學(xué)家Judah Folkman提出“腫瘤血管新生”學(xué)說(shuō)，該理論認(rèn)為新生血管為腫瘤提供生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如果通過(guò)藥物抑制腫瘤血管生成，也就阻斷了腫瘤獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的途徑，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的[24]。腫瘤細(xì)胞可通過(guò)釋放一系列生長(zhǎng)因子如VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞上特異性受體相結(jié)合，促進(jìn)腫瘤血管生成[15]。肝素可以下調(diào)VEGF的表達(dá)，抑制新生血管的形成[15]。

1.3 抑制乙酰肝素酶活性

ECM與BM是支持細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、分化和腫瘤生長(zhǎng)的支架[25]。腫瘤發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移首先要穿過(guò)ECM與BM[26]。腫瘤轉(zhuǎn)移初期，腫瘤細(xì)胞之間的黏附性降低，導(dǎo)致部分腫瘤細(xì)胞從腫瘤組織中脫落，脫落的癌細(xì)胞通過(guò)直接分泌或者間接誘導(dǎo)宿主細(xì)胞分泌多種酶破壞ECM與BM的完整性，進(jìn)而到達(dá)血管，進(jìn)入血液循環(huán)[14]。HSPG是ECM與BM的重要結(jié)構(gòu)，HPA是目前已知體內(nèi)唯一可降解HSPG中的硫酸乙酰肝素的內(nèi)源性D-葡萄糖醛酸內(nèi)切酶[27]。通過(guò)破壞ECM與BM的完整性，HPA可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。肝素含有可被HPA降解的結(jié)構(gòu)單元，通過(guò)與HSPG競(jìng)爭(zhēng)HPA結(jié)合位點(diǎn)，延緩HPA降解ECM與BM的速率，來(lái)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[16]。

1.4 抑制P-和L-選擇素

腫瘤細(xì)胞脫落后進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，其中的小部分癌細(xì)胞可與血小板結(jié)合形成微血栓，在微血栓的保護(hù)下腫瘤細(xì)胞能夠逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，進(jìn)而到達(dá)機(jī)體其他部位形成轉(zhuǎn)移灶[14]。選擇素在腫瘤細(xì)胞與血小板形成微栓塞以及介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。機(jī)體內(nèi)存在3種選擇素，分別為P-選擇素、L-選擇素和E-選擇素[28]。肝素及其衍生物可干擾P-和L-選擇素介導(dǎo)的血小板、白細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的黏附，阻斷腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)發(fā)生轉(zhuǎn)移[17]。P-選擇素主要介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與血小板黏附過(guò)程[29]，L-選擇素在白細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞黏附過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[30]。Borsig等[31]研究發(fā)現(xiàn)在P-選擇素缺陷小鼠體內(nèi), 血小板不能黏附到腫瘤細(xì)胞表面，腫瘤生長(zhǎng)顯著減慢，靜脈注射腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移情況減少；L-選擇素缺陷小鼠體內(nèi)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移減弱，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在P-、L-選擇素雙缺陷鼠中腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)一步減弱[32]。

1.5 抑制上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

肝素亦具有抑制EMT的能力。在腫瘤發(fā)展過(guò)程中，EMT通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞的遷移性、侵襲性與抗凋亡能力，參與腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移[33]，腫瘤干細(xì)胞能夠在間充質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞狀態(tài)之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換，被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移、化療和臨床復(fù)發(fā)過(guò)程中的關(guān)鍵因素[18]。Ponert等[18]研究表明在治療濃度下，UFH與LMWH可以消除或部分減少胰腺癌和前列腺癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，使腫瘤侵襲能力減弱。

2 肝素在藥物遞送系統(tǒng)的應(yīng)用

肝素是廣泛存在于人體細(xì)胞的內(nèi)源性多糖，故具有良好的生物相容性與安全性，給藥時(shí)發(fā)生免疫排異反應(yīng)的概率較低[34]；此外肝素分子中亦存在大量化學(xué)基團(tuán)如羧基、氨基和羥基，這些基團(tuán)為肝素的改性提供了可能，因此肝素及其衍生物被廣泛用于藥物載體[35]。基于肝素的抗腫瘤遞藥系統(tǒng)在增強(qiáng)藥物抗腫瘤療效的同時(shí)，肝素本身亦可發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移功能，而以肝素為基礎(chǔ)的藥物遞送系統(tǒng)可分為納米級(jí)藥物遞送系統(tǒng)、微米級(jí)藥物遞送系統(tǒng)及水凝膠藥物遞送系統(tǒng)（表1），本節(jié)將對(duì)上述體系的設(shè)計(jì)思路及主要研究結(jié)果進(jìn)行綜述。

表1 以肝素為基礎(chǔ)的藥物遞送系統(tǒng)Table 1 Heparin-based drug delivery system

（續(xù)表1）

2.1 納米級(jí)藥物遞送系統(tǒng)

2.1.1 脂質(zhì)體脂質(zhì)體是由磷脂與膽固醇（chol）構(gòu)成的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的藥物遞送載體，其結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜類(lèi)似，在20世紀(jì)60年代首次被報(bào)道[71]。脂質(zhì)體可同時(shí)運(yùn)輸親水性與疏水性藥物[72]，良好的生物相容性、低毒性、高運(yùn)載效率等特點(diǎn)使其得到了廣泛應(yīng)用[73]，且脂質(zhì)體制備工藝簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。Marqibo[74]、Onivyde[75]等脂質(zhì)體產(chǎn)品已被FDA批準(zhǔn)用于癌癥治療。根據(jù)所帶電荷情況可將脂質(zhì)體分為：陽(yáng)離子脂質(zhì)體、陰離子脂質(zhì)體與中性脂質(zhì)體。其中陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有較好的腫瘤組織靶向性，但其電荷不穩(wěn)定性及血液毒性使其在臨床上的應(yīng)用受到了限制[38]。將聚陰離子肝素與陽(yáng)離子脂質(zhì)體通過(guò)靜電作用在較溫和的條件下結(jié)合，可延長(zhǎng)脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間[76]，改變納米粒表面電荷[38]，并且肝素在發(fā)揮自身抗腫瘤轉(zhuǎn)移功效的同時(shí)可與化療、光療等技術(shù)聯(lián)用共同抑制腫瘤生長(zhǎng)。同時(shí)，靜電結(jié)合脂質(zhì)體制備過(guò)程簡(jiǎn)單，易于操作，可批量制備[77]。

Chen等[36]制備了LMWH包被的阿霉素（DOX）陽(yáng)離子脂質(zhì)體（LMWH-DOX-Lip），用于治療腫瘤同時(shí)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明：與未進(jìn)行肝素修飾的脂質(zhì)體相比，LMWH-DOX-Lip顯示出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性（p＜0.01）。此外，研究人員還觀察到LMWH-DOX-Lip能阻斷腫瘤細(xì)胞與活化P-選擇素的黏附，進(jìn)而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。紫杉醇（PTX）是臨床上常用的抗腫瘤藥物，但是研究發(fā)現(xiàn)PTX可通過(guò)增加B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白（BCL-2）的表達(dá)使腫瘤轉(zhuǎn)移性增強(qiáng)。為克服PTX治療中這一問(wèn)題，Yu等[37]設(shè)計(jì)了兩種不同的納米粒，PTX聚乙二醇（PEG）脂質(zhì)體（PTX-Lip）與負(fù)載BCL-2 siRNA（siBCL-2）的LMWH包被的陽(yáng)離子脂質(zhì)體（LH-Lip/siBCL-2），用于治療胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）（圖2）。LMWH既可降低陽(yáng)離子脂質(zhì)體在體內(nèi)的毒性，又可增強(qiáng)脂質(zhì)體的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。PDAC含有大量復(fù)雜的ECM成分，腫瘤間質(zhì)壓力大，納米粒很難遞送到腫瘤內(nèi)部。先給予PTX-Lip誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，降低ECM含量，為后續(xù)納米藥物的攝取掃除障礙，隨后給予LH-Lip/siBCL-2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)明顯抑制，并觀察到明顯的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用。PTX-Lip和LH-Lip/siBCL-2序貫給藥可能為PDAC或其他富含ECM腫瘤的治療提供一種可行的途徑。

為研究肝素修飾的陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面電荷與脂質(zhì)體毒性及藥效間的關(guān)系，Li等[38]將LMWH修飾在包載了姜黃素的陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面，獲得了一系列帶有不同表面電荷的脂質(zhì)體，并從血清穩(wěn)定性、溶血性、細(xì)胞攝取、細(xì)胞毒性和體內(nèi)分布等方面對(duì)制劑進(jìn)行了評(píng)價(jià)，以期在低毒性和高靶向性中獲得平衡。姜黃素是從我國(guó)傳統(tǒng)中藥姜黃提取出來(lái)的，近年來(lái)常用于腫瘤治療[78]。通過(guò)對(duì)脂質(zhì)體表面電荷進(jìn)行調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)表面電荷為5 mV的陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有與陰離子脂質(zhì)體相似的血清穩(wěn)定性和較低的溶血性，且陽(yáng)離子脂質(zhì)體在細(xì)胞攝取率方面更具優(yōu)勢(shì)，此結(jié)果對(duì)后期肝素靜電修飾脂質(zhì)體電荷選擇的研究提供了重要參考價(jià)值。

圖2 LH-Lip/siBCL-2聯(lián)合化療對(duì)胰腺腫瘤及轉(zhuǎn)移的影響：（a）LH-Lip/siBCL-2的制備；（b）給予小劑量PTX-Lip，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)后續(xù)LH-Lip/siBCL-2釋放；（c）給予LH-Lip/siBCL-2抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，下調(diào)BCL-2的表達(dá)[37]Fig. 2 Effect of LH-Lip/siBCL-2 combined chemotherapy on pancreatic tumor and metastasis:（a）Preparation of LH-Lip/siBCL-2;（b）A low dose of PTX-Lip was administered as a tumor-priming agent to regulate the tumor microenvironment and promote the delivery of nanodrugs;（c）LH-Lip/siBCL-2 was sequentially administrated to inhibit cancer metastasis and downregulate the expression of BCL-2 [37]

2.1.2 膠束膠束是由兩親性嵌段共聚物構(gòu)成的納米級(jí)藥物遞送載體，可在臨界膠束濃度以上自組裝成球形納米粒子。膠束的疏水內(nèi)核可用于儲(chǔ)存難溶性藥物，常被設(shè)計(jì)用于增加難溶性藥物的溶解度[79]。Acharya等[41]制備了一種以N-正辛基-N-三甲基殼聚糖（OTMC）為基礎(chǔ)的包載PTX的陽(yáng)離子膠束PTX-SN。OTMC是一種具有增溶和腫瘤靶向作用的兩親性殼聚糖聚合物，由于PTX-SN所帶的正電荷易引起嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，因此研究者在陽(yáng)離子聚合物表面包裹聚陰離子肝素形成PTX-HSN膠束，以克服陽(yáng)離子膠束的毒性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PTX-HSN膠束在保持高攝取效率的同時(shí)，細(xì)胞毒性和溶血性都顯著降低；藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)表明PTX-HSN膠束在大鼠循環(huán)中的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)于游離藥物。Mei等[42]利用疏水基脫氧膽酸鹽和腙鍵將DOX與肝素結(jié)合，構(gòu)建了一種新型pH敏感自組裝膠束HD-DOX（圖3）。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞外pH為6.5～7.2，低于正常組織的pH 7.4，基于腫瘤組織這一性質(zhì)，pH敏感膠束可更好地發(fā)揮治療作用[80]。研究人員利用具有良好生物相容性和生物可降解性的肝素作為藥物遞送載體，不僅發(fā)揮賦形劑的作用，而且利用肝素獨(dú)特的抗血管生成作用這一特點(diǎn)與抗腫瘤藥物DOX協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明HD-DOX可延長(zhǎng)小鼠的中位生存時(shí)間至26.9 d，顯著長(zhǎng)于用生理鹽水組（17.9 d）與肝素組（18.6 d）。同時(shí)研究人員還探索了肝素抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)肝素可能會(huì)通過(guò)破壞腫瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白應(yīng)激纖維的組織，并且通過(guò)阻礙血小板與腫瘤細(xì)胞的相互作用阻斷血小板誘導(dǎo)的EMT，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

2.1.3 納米凝膠納米凝膠是由兩親性或親水性高分子鏈組成的可膨脹三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，尺寸為50～200 nm，納米凝膠載藥量高、穩(wěn)定性高、可注射，是性能優(yōu)越的藥物遞送載體[81]。Bae等[47]利用肝素衍生物硫代肝素與PEG形成納米復(fù)合物，然后通過(guò)超聲波在硫代肝素分子之間生成分子間二硫鍵，合成了還原性肝素納米凝膠。PEG具有很強(qiáng)的親水性與生物相容性，不易黏附于細(xì)胞及蛋白表面，是用作納米凝膠載體的優(yōu)良材料[82]。在腫瘤微環(huán)境中，環(huán)境敏感納米凝膠中的二硫鍵斷裂，釋放出游離肝素，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。Nguyen等[48]設(shè)計(jì)了一種脂質(zhì)包裹的納米凝膠藥物遞送系統(tǒng)，用于核糖核酸酶（RNase）的遞送。納米凝膠雖然載藥量高、穩(wěn)定性好，但是其高含水量以及多孔結(jié)構(gòu)易造成藥物的快速釋放，此外血液循環(huán)中的巨噬細(xì)胞等易誘導(dǎo)納米凝膠降解。脂質(zhì)體與極性蛋白質(zhì)作用力弱，不適于運(yùn)載蛋白質(zhì)類(lèi)藥物。這一混合系統(tǒng)彌補(bǔ)了各自系統(tǒng)的缺點(diǎn)，與未包封含藥納米凝膠的脂質(zhì)體相比，混合納米遞送載體RNA酶的負(fù)載量幾乎增加了一倍。由于外層脂質(zhì)膜的存在，RNase的釋放時(shí)間延長(zhǎng)了4 d以上，且制劑的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)高于游離RNA酶。這一混合遞送載體有望在腫瘤靶向治療中發(fā)揮作用。Wu等[49]在未使用表面活性劑條件下，利用乙烯基衍生物與胱胺雙丙烯酰胺共聚，制備得到了具有還原敏感性的肝素納米凝膠。該納米凝膠的粒徑可在80～200 nm調(diào)節(jié)，并具有較高的DOX載藥量（約30 %）。以荷瘤小鼠為模型動(dòng)物評(píng)價(jià)負(fù)載DOX納米凝膠的體內(nèi)抗腫瘤療效并與游離DOX組進(jìn)行對(duì)比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明給藥15 d后，負(fù)載DOX納米凝膠組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率為87 %，明顯高于游離DOX組的66%（p＜0.05）。

圖3 （a）膠束納米粒HD-DOX及其功能示意圖；（b）治療結(jié)束后，在小鼠尾靜脈注射B16F10細(xì)胞，18 d后肺部圖片（n = 6,mean ± SD）；（c）小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移區(qū)域（n = 6,mean ± SD）；（d）肺切片組織學(xué)分析[42]Fig. 3 （a）Constructions and functions of HD-DOX;（b）Pictures of lungs 18 d after injection of B16F10 cells via tail vein（n = 6, mean ± SD）;（c）Metastasis areas of lungs（n = 6, mean ± SD）;（d）Histological analysis of lung sections[42]

2.1.4 納米粒結(jié)構(gòu)豐富、功能各異的聚合物納米粒具有包封率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)，已成為構(gòu)建藥物遞送載體的熱門(mén)選擇[83]。有些聚合物納米粒同樣帶有較強(qiáng)的正電性，例如聚乙烯亞胺（PEI）[84]、殼聚糖（CS）[85]、聚丙烯亞胺（PPI）[86]，將肝素修飾在它們表面不僅可降低納米粒的毒性，亦可利用肝素易與蛋白結(jié)合的特點(diǎn)提高納米粒體內(nèi)腫瘤靶向性[84]。

Yuk等[52]在包載PTX的泊洛沙姆（Pluronic F-68）納米粒表面通過(guò)氫鍵作用修飾乙二醇?xì)ぞ厶牵℅lycol chitosan），而后利用離子鍵作用在納米粒周?chē)揎椄嗡兀▓D4）。在負(fù)載PTX的納米粒表面負(fù)載親水性Glycol chitosan和肝素后，疏水性藥物PTX的釋放速率降低。通過(guò)實(shí)體瘤高通透性和滯留（EPR）效應(yīng)被動(dòng)靶向腫瘤的納米粒在體內(nèi)應(yīng)有較長(zhǎng)的半衰期，PEG與肝素可減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的調(diào)理作用，延長(zhǎng)納米粒在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間[87]。體內(nèi)靶向?qū)嶒?yàn)顯示復(fù)合納米粒的熒光強(qiáng)度大于Pluronic納米粒組，與游離PTX組及未修飾Pluronic組相比，長(zhǎng)循環(huán)納米粒的藥峰濃度和藥時(shí)曲線下面積值最高。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果有力證明了肝素修飾納米粒循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)，可在體內(nèi)控制藥物釋放。

圖4 （a）納米粒的構(gòu)建；（b）PTX/Cy5.5-loaded NPs活體成像圖及定量分析結(jié)果；（c）72 h后處死負(fù)載鱗狀癌細(xì)胞（SCC-7）的小鼠，各器官體外白光及近紅外成像及定量分析結(jié)果[52]Fig. 4 （a）Construction of LNP;（b）In vivo noninvasive NIR images and quantification analysis of TX/Cy5.5-loaded NPs;（c）Ex vivo white light images and NIR images and quantification analysis of dissected organs of mice bearing SCC-7 cells sacrificed at 72 h[52]

通過(guò)非化學(xué)鍵結(jié)合制備的納米粒工藝簡(jiǎn)單、風(fēng)險(xiǎn)低、易于工業(yè)化生產(chǎn)，但是納米粒穩(wěn)定性不佳、整體性能較差。為使藥物更好地發(fā)揮療效，提高制劑安全性、穩(wěn)定性，研究人員利用肝素表面基團(tuán)對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾，例如將化療藥物與之共價(jià)結(jié)合形成高分子前藥，或者將肝素與其他疏水性物質(zhì)接枝得到兩親性共聚物包載輸水性藥物。以肝素為骨架構(gòu)建的藥物遞送系統(tǒng)可更加靈活地滿足治療需要。

上世紀(jì)70年代德國(guó)科學(xué)家Ringsdorf提出了“高分子前藥”這一概念，與小分子前藥相比高分子前藥在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)，不易被網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)清除，難溶性藥物與載體通過(guò)化學(xué)鍵合在循環(huán)過(guò)程中不易泄漏[88]。肝素親水性極強(qiáng)，又具有多種可發(fā)生化學(xué)鍵合的基團(tuán)，難溶性藥物直接與親水性肝素接枝，不僅改善了難溶性藥物的溶解度，又改善了其在生理作用下的水解速率。與其他載體材料相比，肝素還具有獨(dú)特的抗腫瘤活性，可與所連接的藥物協(xié)同發(fā)揮作用，抑制腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移。

Andrgie等[53]制備了氧化還原敏感性氯霉素-肝素前藥（Hep-Chl），肝素與氯霉素（Chl）通過(guò)二硫鍵相連，在生理?xiàng)l件下可進(jìn)行自組裝。Hep-Chl在循環(huán)過(guò)程中穩(wěn)定，通過(guò)EPR效應(yīng)到達(dá)腫瘤部位后，由于腫瘤部位特殊的微環(huán)境敏感鍵斷裂使藥物得以釋放。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明這些納米粒能夠被人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）及人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）有效攝取，Hep-Chl中的二硫鍵會(huì)在高氧化還原電位的癌細(xì)胞中斷裂，釋放Chl與Hep，發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。為提高肝素使用的安全性，研究人員在肝素與藥物之間插入一些小分子物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)這一舉措有助于降低肝素制劑的抗凝血性，降低使用后的出血風(fēng)險(xiǎn)。Wang等[54]將3種不同氨基酸修飾的肝素綴合物與抗癌藥物PTX接枝得到了三元給藥系統(tǒng)（HD2a，HD2b和HD2c，后統(tǒng)稱(chēng)HD2），并與通過(guò)直接酯鍵法制備的肝素-PTX化合物（HD1）對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HD2水溶性更佳且抗凝作用明顯降低，體外釋放實(shí)驗(yàn)表明HD2的藥物釋放速率明顯高于HD1，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示HD2結(jié)合物的抗癌作用顯著。單純依靠被動(dòng)靶向作用運(yùn)輸?shù)侥[瘤細(xì)胞內(nèi)部的藥物濃度還是較低，納米粒易在肝、脾等部位累積；為提高藥物在靶部位濃度，增強(qiáng)藥物療效，中山大學(xué)Wang等[55]利用αvβ3整合素靶向肽cRGD與肝素接枝，同時(shí)在肝素上修飾疏水性葉酸制備兩親性肝素衍生物cRGD-NPs2，cRGD不僅可作為靶頭，將納米粒主動(dòng)靶向至腫瘤部位，還可抑制內(nèi)皮依賴(lài)性血管（EDV）和腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成擬態(tài)（VM）作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明cRGD-NPs2在體外表現(xiàn)出顯著的血管抑制作用（68% ± 6%，p＜0.001），可顯著減少自發(fā)性血管生成（15% ± 0.7%，血管面積，p＜0.001）。經(jīng)cRGD-NPs2治療后，絨毛尿囊膜的微小邊界和毛細(xì)血管消失，誘導(dǎo)了EDV強(qiáng)烈的抗血管生成反應(yīng)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)顯示，肝素在治療中發(fā)揮著協(xié)同抗血管生成作用。

并非所有藥物都適合通過(guò)共價(jià)鍵與載體相連，在肝素分子上接枝疏水分子形成兩親性聚合物再包載疏水性藥物，通過(guò)自組裝作用形成納米粒是制備以肝素為骨架的納米藥物遞送系統(tǒng)的常用策略。Sun等[59]人利用腫瘤組織中谷胱甘肽濃度明顯高于正常組織這一特點(diǎn)，將LMWH與膽固醇接枝制備了兩親性聚合物L(fēng)MWH-Chol2，并在LMWH-Chol2上共價(jià)修飾硫辛酸得到聚合物L(fēng)LHC2，設(shè)計(jì)合成了氧化還原敏感的納米粒DOX/cLLHC2。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DOX/cLLHC2具備優(yōu)秀的抗腫瘤轉(zhuǎn)移與抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力，DOX/cLLHC2治療的小鼠肺部幾乎沒(méi)有轉(zhuǎn)移灶，體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)證明DOX/cLLHC2的腫瘤殺傷能力明顯高于游離的DOX組。

無(wú)機(jī)納米材料由于具有獨(dú)特的理化性質(zhì)，除作為藥物遞送載體外還具有癌癥治療、診斷的潛力[89]。無(wú)機(jī)納米材料普遍存在溶解性差、生物相容性差等劣勢(shì)，肝素及其衍生物可有效改善無(wú)機(jī)納米材料的生物相容性[90]，同時(shí)肝素所特有的抗凝血、抗腫瘤等功能也可與無(wú)機(jī)納米材料一起協(xié)同發(fā)揮作用[91]。金納米粒本身可調(diào)控腫瘤組織VEGF通路異常激活，抑制血管生成[92]，與肝素接枝后納米粒抗腫瘤血管生成作用增強(qiáng)[63]。例如Lee等[62]將熒光染料標(biāo)記的肝素修飾在金納米粒上制備兼具癌細(xì)胞成像與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的多功能納米粒子AuNPs，肝素在其中發(fā)揮了納米粒增溶、防聚集、抗血管生成等作用。Kemp等[63]設(shè)計(jì)了2,6-二氨基吡啶基肝素修飾的金/銀納米粒，實(shí)驗(yàn)表明修飾后的納米粒子能有效抑制堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF-2）誘導(dǎo)的血管生成。磁性納米粒在腫瘤細(xì)胞成像方面具有重要意義，Yang等[64]將DOX及肝素包裹在超順磁性氧化鐵納米粒表面，并將納米粒命名為DH-SPIO-NPs，與游離DOX相比，DH-SPIO-NPs在抑制腫瘤生長(zhǎng)與延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存期方面具有更優(yōu)良的療效，其中肝素發(fā)揮了降低化療藥物毒性與藥物緩釋的作用。同樣研究人員利用氧化石墨烯（rGO）的光熱性能，以己二酸二酰肼為連接劑，將肝素接枝到rGO上，并負(fù)載姜黃素的熱療與化療聯(lián)用納米遞藥系統(tǒng)，與其他rGO制劑相比，該藥物遞送系統(tǒng)具有更加優(yōu)良的穩(wěn)定性和生物相容性，LMWH涂層rGO納米片在生理?xiàng)l件下至少保持24 h的穩(wěn)定分散[65]。Wu等[67]將肝素共價(jià)結(jié)合到介孔硅表面，制備得到MSNs-HP，并負(fù)載DOX得到DOX-loaded MSNs-HP；在該遞藥系統(tǒng)中，肝素不僅能改善納米粒的生物相容性與分散性，還可與DOX協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成。無(wú)機(jī)材料與肝素結(jié)合后穩(wěn)定性、生物相容性、抗腫瘤療效等都得到了提升，為抗腫瘤治療提供了新思路。

2.2 微米級(jí)藥物遞送系統(tǒng)

圖5 （a）肝素改性PEG水凝膠的合成；（b）利用活體成像監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)以及治療后小鼠原發(fā)腫瘤質(zhì)量；（c）第6周小鼠的活體成像圖和癌細(xì)胞在第6周轉(zhuǎn)移到器官的圖像[70]Fig. 5 （a）Synthesis of heparin-modified polyethylene glycol hydrogels;（b）Monitoring tumor growth in vivo by bioluminescence imaging and primary tumour mass of mice;（c）Bioluminescence images of mice at week 6 and metastatic spread of cancer cells to organs at week 6[70]

肝素在微米級(jí)藥物遞送系統(tǒng)中同樣發(fā)揮著重要作用，在微米級(jí)藥物遞送系統(tǒng)中微膠囊的使用較為廣泛[93]。Chen等[68]利用層層自組裝法制備了負(fù)載DOX的肝素/CS微膠囊（HEP/CHI）5，用于腫瘤治療。研究表明肝素可通過(guò)干擾轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但由于肝素帶負(fù)電荷，其很難被細(xì)胞吸收。有報(bào)告指出帶正電荷的載體能克服這一障礙。研究人員將CS作為正電荷聚電解質(zhì)，肝素通過(guò)層層自組裝法制備了（HEP/CHI）5多層膜膠囊。微膠囊在水介質(zhì)中直徑約為5 μm，在干燥狀態(tài)下直徑約為4 μm。共聚焦結(jié)果表明DOX包被在微膠囊的囊壁和腔內(nèi)，而肝素位于微膠囊的囊壁。體外A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)（HEP/CHI）5具有pH響應(yīng)性釋藥行為，能實(shí)現(xiàn)DOX和肝素細(xì)胞內(nèi)共給藥，實(shí)現(xiàn)協(xié)同抗腫瘤作用。

2.3 水凝膠

具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的水凝膠可吸收水與體液，常被用于藥物遞送載體。Andrgie等[69]將PEG在Sn（Oct）2存在的條件下，與ε-己內(nèi)酯及D,L-丙交酯開(kāi)環(huán)共聚形成PCLA-PEG-PCLA共聚物，并將肝素通過(guò)酯化反應(yīng)與PCLA-PEG-PCLA結(jié)合制備可降解的溫敏水凝膠，用于腫瘤切除后抗轉(zhuǎn)移治療。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)可注射水凝膠能有效抑制腫瘤細(xì)胞遷移，減少裸鼠肺轉(zhuǎn)移灶。Seib等[70]將PEG與肝素通過(guò)共價(jià)交聯(lián)制備親水凝膠骨架PEG-heparin，抗癌藥物DOX通過(guò)靜電作用載入骨架中制備成易于注射的水凝膠（圖5）。將DOX負(fù)載的PEG肝素水凝膠微粒聚集體局部注射到已建立人類(lèi)原位乳腺腫瘤的小鼠體內(nèi)，與靜脈注射同等劑量DOX組相比，水凝膠組通過(guò)減少原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤反應(yīng)。

3 總結(jié)與展望

雖然近年來(lái)以肝素為基礎(chǔ)的藥物遞送系統(tǒng)研究已取得了廣泛的進(jìn)展，但在實(shí)際應(yīng)用中仍存在一些問(wèn)題與挑戰(zhàn)：

（1）肝素使用過(guò)程中的出血風(fēng)險(xiǎn)仍然是限制以肝素為基礎(chǔ)的藥物遞送系統(tǒng)應(yīng)用于臨床的一個(gè)重要障礙，雖然LMWH的出現(xiàn)在一定程度上緩解了這個(gè)問(wèn)題，但其在臨床應(yīng)用中同樣存在出血風(fēng)險(xiǎn)；

（2）大部分以肝素為基礎(chǔ)的遞藥系統(tǒng)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，制備工藝繁瑣，并不適合進(jìn)行工業(yè)化制備；

（3）肝素的質(zhì)量控制也是制約肝素制劑應(yīng)用于臨床的一個(gè)方面，由于肝素主要來(lái)源于動(dòng)物組織，在生產(chǎn)過(guò)程中肝素的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有一定的不確定性，質(zhì)量控制較困難，臨床上曾報(bào)道因肝素污染導(dǎo)致患者死亡的事件。

在未來(lái)的研究中，科研工作者可聚焦肝素抗凝血機(jī)制的研究，簡(jiǎn)化肝素藥物遞送系統(tǒng)的制備過(guò)程，使制劑更適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)，建立科學(xué)可靠的肝素質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。相信隨著研究人員的不斷探索，未來(lái)出血風(fēng)險(xiǎn)更低、臨床使用更加安全的肝素制劑將被廣泛應(yīng)用于臨床，肝素制劑的使用亦具有廣闊前景。