外周血乳酸及細胞毒性T淋巴細胞在口腔鱗狀細胞癌中的臨床應用研究*

趙 紅，馮芝恩，李德龍，段立莉，栗景蕊△

首都醫科大學附屬北京口腔醫院：1.檢驗科；2.口腔頜面-頭頸腫瘤科，北京 100050

早在1930年，奧托·沃伯格就證明了癌細胞即使在氧氣存在的情況下也依賴糖酵解作用，這種現象被稱為有氧糖酵解，即“Warburg效應”[1]。與正常細胞相比，腫瘤細胞具有代謝表型改變的特點。腫瘤細胞可以利用糖酵解產生能量，并產生大量乳酸(LA)。有研究表明，LA對人細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的增殖和細胞因子產生的抑制率高達95%，細胞毒活性可降低50%[2]，使機體細胞免疫功能下降，從而為癌細胞的生長擴散提供有利條件。口腔鱗狀細胞癌(簡稱鱗癌)是指發生于口腔內，以鱗狀細胞為主的惡性腫瘤。癌細胞可以發生于牙齦、硬腭、舌體、頰黏膜、嘴唇等等多種器官，屬于頭頸部惡性程度最高、危害性最大的腫瘤[3]。目前，腫瘤微環境代謝變化引起的CTL的變化在口腔鱗癌中的作用研究相對較少。本文通過測定分析健康者與不同臨床分期的口腔鱗癌患者外周血LA及CD8+T細胞水平，從口腔鱗癌患者代謝水平與機體免疫功能的關系方面，探討LA及CTL在口腔鱗癌發生、發展中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年11月至2020年9月在本院口腔頜面-頭頸腫瘤科住院治療的口腔鱗癌患者50例為試驗組。納入標準：年齡20～70歲，經病理組織學診斷為鱗癌且未進行放化療處置者。排除標準：(1)既往有其他腫瘤史者；(2)伴有其他系統性疾病者；(3)不愿意參與此項研究者。 試驗組年齡20～70歲；男26例，女24例；舌癌18例，牙齦癌11例，口底癌11例，頰癌5例，唇癌5例；TNM分期[美國癌癥聯合會(AJCC)第八版]Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期25例。另選擇同期在本院口腔頜面-頭頸腫瘤科住院患者的陪護家屬且身體健康者70例為對照組，年齡20～70歲，其中男36例，女34例。2組年齡、性別構成差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究方案獲得首都醫科大學附屬北京口腔醫院倫理委員會批準(審查批件號：CMUSH-IRB-KJ-PJ-2018-14)，所有研究對象均簽署了知情同意書。

1.2儀器與試劑 白洋離心機購自北京白洋醫療器械有限公司，Sysmex XS-500i血細胞分析儀購自日本Sysmex公司，Siemens RXL-MAX生化分析儀購自德國Siemens公司，FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司。血常規檢測試劑為血細胞分析儀配套試劑，LA測定試劑為生化分析儀配套試劑。Fc受體封閉劑、PerCP-Cy5.5標記的CD3單克隆抗體(CD3-PerCP-Cy5.5)、異硫氰基熒光素(FITC)標記的CD8單克隆抗體(CD8-FITC)均購自達科為生物技術股份有限公司，一次性含氟化鈉真空采血管和一次性EDTA抗凝真空采血管購自美國BD公司。

1.3方法

1.3.1標本采集與處理 采用一次性含氟化鈉真空采血管和一次性EDTA抗凝真空采血管，每管內采集所有研究對象空腹外周靜脈血2 mL。一次性含氟化鈉真空采血管內外周血以2 500 r/min離心10 min，取上層血漿立即進行LA含量測定。一次性EDTA抗凝真空采血管內外周血顛倒混勻8次后即進行血常規檢測，完成血常規檢測后的標本用于流式細胞分析。

1.3.2標本檢測 用全血細胞分析儀進行血常規檢測，得出淋巴細胞計數。對分離的血漿立即用全自動生化分析儀及LA測定試劑盒檢測LA水平。從EDTA抗凝管中取100 μL新鮮靜脈血，加入Fc受體封閉劑5 μL，室溫孵育10 min后，分別加入CD3-PerCP-Cy5.5、CD8-FITC各3 μL，在室溫下避光孵育20 min，然后加入紅細胞裂解液2 mL，室溫避光裂解紅細胞15 min，350×g離心5 min，棄去上清液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)2 mL離心洗去血紅蛋白，并重新懸浮于300 μL PBS中，用流式細胞儀檢測2組CD3+和CD8+雙陽性T細胞的百分比。根據淋巴細胞計數及CD3+和CD8+雙陽性T細胞的百分比計算出2組研究對象外周血CTL的絕對值。

2 結 果

2.1試驗組與對照組外周血LA、淋巴細胞計數及CTL水平比較 對2組外周血LA、淋巴細胞計數及CTL水平進行方差齊性檢驗，2組的LA、淋巴細胞計數及CTL水平方差齊。采用t檢驗對2組外周血LA、淋巴細胞計數及CTL水平進行比較，結果顯示，試驗組LA水平高于對照組，淋巴細胞計數和CTL水平低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 試驗組與對照組LA、淋巴細胞計數及CTL水平比較

2.2不同TNM分期口腔鱗癌患者外周血LA、淋巴細胞計數及CTL水平比較 對Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期口腔鱗癌患者外周血LA、淋巴細胞計數及CTL水平進行方差齊性檢驗，2組不同TNM分期口腔鱗癌患者的LA、淋巴細胞計數及CTL水平方差齊。采用t檢驗對2組不同TNM分期口腔鱗癌患者外周血LA、淋巴細胞計數及CTL水平進行比較，結果顯示，Ⅲ～Ⅳ期口腔鱗癌患者的LA水平高于Ⅰ～Ⅱ期，CTL水平低于Ⅰ～Ⅱ期，差異均有統計學意義(P<0.05)，而淋巴細胞計數差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同TNM分期口腔鱗癌患者LA、淋巴細胞計數及CTL水平比較

2.3口腔鱗癌患者LA水平與CTL水平的相關性分析 Pearson相關分析顯示，隨著口腔鱗癌患者LA水平升高，CTL水平相應降低，其LA水平與CTL呈負相關(r=-0.551，P<0.05)，見圖1。

圖1 口腔鱗癌患者LA水平與CTL間關系散點圖

3 討 論

口腔鱗癌患者LA水平與健康者比較明顯升高，說明腫瘤細胞糖酵解作用增強,使pH值下降。腫瘤微環境的缺氧狀態可以上調編碼葡萄糖轉運蛋白和LA脫氫酶基因，從而增加了LA的分泌，且糖酵解作用也產生大量LA。GATENBY等[4]提出腫瘤細胞的這種“糖酵解代謝”具有生長優勢，是人類侵襲性癌癥進化的必要條件。WALENTA等[5-7]發現腫瘤組織中LA水平與腫瘤轉移的發生率以及癌癥患者總體生存率的降低之間存在相關性。FISCHER等[2]的研究中也提示了140例患有不同實體腫瘤的患者血清LA水平與腫瘤負荷之間可能相關。本研究顯示，在不同臨床分期的口腔鱗癌患者中，Ⅲ～Ⅳ期口腔鱗癌患者LA水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)，表明LA水平與口腔鱗癌的發展可能相關，這一指標對預測腫瘤的發生和發展有一定的指導意義。

口腔鱗癌患者外周血淋巴細胞計數水平明顯低于健康者(P<0.05)，與機體抗腫瘤免疫有關，說明細胞免疫在口腔鱗癌中發揮著重要作用。但在不同分期的口腔鱗癌患者中，Ⅲ～Ⅳ期口腔鱗癌患者同Ⅰ～Ⅱ期口腔鱗癌患者比較，外周血淋巴細胞計數水平差異無統計學意義(P>0.05)。可能是由于隨著腫瘤的進展，主要是CTL的作用逐漸減弱[8]，淋巴細胞亞群比例發生變化，而淋巴細胞計數作為口腔鱗癌進展程度的篩查指標靈敏度較差。

根據SAVINA等[9]的研究結果，針對腫瘤抗原的有效免疫反應需要活化和募集CD8+T細胞，從而發揮細胞毒效應。本研究中口腔鱗癌患者相對健康者而言，發揮細胞毒作用的CD8+T細胞水平明顯降低，且口腔鱗癌晚期患者相對于早期患者而言，CTL下降更為明顯(P<0.05)，也反映了腫瘤發生、發展過程中機體免疫監視狀況的變化，越是進展到口腔鱗癌的晚期，CTL水平的下降越明顯，從而更有利于癌細胞的浸潤生長。FISCHER等[2]的研究中顯示，浸潤性CTL在進入腫瘤部位后不久就失去了重要的功能，其關鍵特征是細胞溶解能力受阻。口腔鱗癌可來源于一些惡性病變，如黏膜白斑。如果病變提示口腔上皮發育不良，則惡性轉化的可能性增加[10]。機體免疫系統在識別腫瘤前體細胞中發揮重要作用。根據免疫監視和免疫編輯假說，腫瘤細胞可以逃避免疫系統的監視。這個假說認為宿主和惡性細胞之間的相互作用是由3個階段驅動的，即消除期、平衡期、逃逸期。一些腫瘤細胞在消除階段被識別并清除，一些惡性轉化細胞能夠存活至平衡期。在逃逸期，持續生存的細胞增殖為腫瘤[11]。口腔鱗癌患者中也存在著明顯的細胞免疫功能降低。

LA水平與CTL的相關性分析顯示，隨著口腔鱗癌患者LA水平升高，CTL水平相應降低，說明腫瘤細胞特有的代謝特征會對機體免疫系統產生影響，并在口腔鱗癌的進展中發揮作用。LA可以抑制人CTL的增殖，從而利于腫瘤細胞的轉移生長。LA酸中毒常見于大多數實體瘤患者，且影響免疫細胞的浸潤[12]。單羧酸轉運蛋白-1(MCT-1)是細胞轉運LA的蛋白，在心臟、肝臟、小腸、骨髓、骨骼肌、脾臟、大腦等組織中高表達[13]，其對LA的轉運依賴于細胞質與胞外LA的水平梯度。有報道指出淋巴細胞也有MCT-1、MCT-2、MCT-4的表達[14]。腫瘤微環境中高水平的LA阻礙了MCT-1向T細胞外轉運LA，從而干擾了T細胞的代謝和功能，影響機體的免疫功能。活化的T細胞利用糖酵解作用依賴于LA的有效分泌[15]。如果LA積累在細胞內，則會干擾其新陳代謝，最終抑制CTL的增殖和活化。口腔鱗癌患者在LA升高的同時伴隨著CTL的下降，可能與腫瘤微環境中高水平LA的積累有關。

綜上所述，口腔鱗癌患者外周血LA水平的增高伴隨著CTL水平的下降，說明癌細胞的糖酵解代謝可能會對機體免疫系統產生影響，提示了口腔鱗癌患者腫瘤微環境中高水平的LA積累使CTL中的LA分泌受阻，干擾了T細胞代謝，抑制其細胞毒性效應的發揮。外周血LA和CTL水平與口腔鱗癌的發生、發展有關，可以作為潛在的口腔鱗癌病情評估的篩查指標。