花青素對牛血清白蛋白的光譜特性及構象的影響

趙旭紅，夏彩芬，周紫薇，莊文麗，郭梅英

（湖北工程學院化學與材料科學學院，湖北孝感 432000）

花青素（Anthocyanin, ACN）是一類水溶性天然色素，屬黃酮類化合物，主要來源于蘿卜、爬山虎、紫薯、葡萄、板栗等植物中[1-3]。花青素是天然抗氧化劑，具有強效抗氧化性，可與生物體內其他分子相互作用而產生抗氧化等功效，減少自由基對人體細胞的傷害，起到抗氧化及抗衰老的作用，從而保護人體免疫系統[4-7]。有研究表明，花青素有抑菌活性，能影響腸道微生物菌群，可以抑制部分腸道病原菌數量，增加雙歧桿菌和乳酸桿菌等益生菌的數目，增強腸道屏障功能，花青素基于天然色素和抗氧化性這兩個特性，在醫(yī)藥、食品及化妝品工業(yè)均有所應用[5,7-10]。

牛血清白蛋白（BSA）常用作小分子藥物研究的作用靶標，同時基于BSA中三個發(fā)射熒光氨基酸殘基（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸），ACN與BSA結合，能減緩BSA的氧化進程，從而起到保護BSA的作用[11]。為了進一步研究ACN與BSA作用機理及對BSA功能構象的影響，本文采用熒光光譜法、紫外-可見光吸收法、圓二色譜法、傅利葉紅外光譜法等聯用的方式分析了ACN與BSA相互作用過程中的光譜變化情況，獲取BSA熒光強度、發(fā)射峰、吸收峰特征等指標。通過理論模型對這些指標參數的分析，計算得到結合常數、結合位點數、結合距離等信息，從而闡明ACN與BSA相互作用的機理及對BSA功能結構的影響，為ACN在醫(yī)藥、食品及化妝品工業(yè)的發(fā)展提供可靠的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花青素（anthocyanin，ACN） 分析純，大連美侖生物技術有限公司，實驗中濃度為4×10-3mol/L；牛血清白蛋白（BSA） Sigma公司；華法林 分析純，山東西亞化學工業(yè)有限公司；布洛芬 分析純，上海薩恩化學技術有限公司；實驗用水 均為超純水。

FLS920熒光光譜儀 英國愛丁堡儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Chirascan圓二色光譜儀

英國應用光物理公司；Nicolet-380傅利葉紅外光譜儀 美國熱電高力公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制 BSA溶液：將BSA（Mr=66430）溶于PBS緩沖溶液中，配制成濃度為1×10-3mol/L的BSA儲備液，保存于4 ℃冰箱備用，使用時根據需要以PBS稀釋至所需濃度；ACN溶液：用無水乙醇配制成本體濃度為4×10-3mol/L的ACN儲備液[2-3]。

1.2.2 熒光光譜 熒光實驗中設置比色皿內BSA溶液終濃度為1×10-5mol/L，ACN溶液本體濃度為4×10-3mol/L。各熒光實驗中滴入的ACN含量呈濃度梯度增加[2]。

1.2.2.1 變溫熒光 設置ACN與BSA濃度比為0:1（a）、1:1（b）、2:1（c）、3:1（d）、4:1（e）、5:1（f）、6:1（g）、7:1（h）、8:1（i）。在激發(fā)波長280 nm和狹縫3 nm條件下，分別掃描298、304和310 K時，ACN-BSA體系的熒光光譜，波長范圍為300～500 nm[2]。

1.2.2.2 同步熒光 設置ACN與BSA濃度比為0:1（a）、1:1（b）、2:1（c）、3:1（d）、4:1（e）、5:1（f）、6:1（g）、7:1（h）、8:1（i）。固定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，在激發(fā)波長280 nm、狹縫寬度3 nm和發(fā)射波長340 nm、狹縫寬度5 nm的條件下，掃描250～400 nm范圍內BSA和ACN溶劑體系的同步熒光光譜[2,6]。

1.2.2.3 位點競爭 設置ACN與BSA混合后的濃度比例分別為1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1。選用兩種位點競爭劑布洛芬和華法林，固定激發(fā)波長為280 nm，在298 K的條件下分別測定不同探針下的熒光光譜[12]。

1.2.3 紫外-可見吸收光譜 據文獻[3]報道，ACN加入會導致BSA在280 nm處吸光度下降，經過重復實驗，本研究中設置紫外光譜實驗中BSA濃度為1×10-5mol/L(a)，ACN與BSA混合后的濃度比例分別為1:1（b）、2:1（c）、3:1（d）、4:1（e）、5:1（f）、6:1（g）。固定掃描區(qū)間為190～400 nm，測定在298 K條件下的紫外-可見吸收光譜。

1.2.4 圓二色譜 BSA終濃度為5×10-6mol/L(a)，ACN和BSA混合液濃度比分別為1:1（b）和2:1（c），固定波長在180 ～260 nm之間，在持續(xù)通氮氣的條件下，分別測定298 K時不同溶劑體系的圓二色譜圖[12]。

1.2.5 紅外光譜 BSA終濃度為1×10-5mol/L，BSA與ACN混合體系的濃度比為1:6。固定掃描區(qū)間為2000～1600 cm-1，利用液膜法分別測定不同溶劑體系的紅外光譜[2]。

參與式學習的互動由兩部組成：一是老師引導為主，學生參與；二是學生發(fā)現問題主動與老師交流教師與學生之間的互動和教師引導下的學生之間的互動。在這種模式下，學習過程中學生是積極地一方。學生只有積極參與學習內容或任務，才能深入學習。

1.3 數據處理

本文運用Origin 2018、OMNIC 8.0、CDNN等軟件處理實驗數據，獲得ACN與BSA相互作用的機理及熱力學特征。根據熱力學公式計算得到ACN與BSA之間的熱力學常數。

2 結果與分析

2.1 熒光光譜分析

2.1.1 變溫熒光分析

2.1.1.1 ACN對BSA猝滅方式的判定 熒光猝滅類型分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，可以依據體系對溫度的變化趨勢來判斷動態(tài)和靜態(tài)猝滅[12]，動態(tài)猝滅常數隨著溫度的增大而增大，而靜態(tài)猝滅常數隨著溫度的增大而減小。假設ACN對BSA的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅，則該猝滅服從Stern-Volmer方程[13-15]：

式（1）中：F0、F為未加入和已加入ACN時BSA的熒光強度；[Q]為ACN的摩爾濃度；Ksv為猝滅常數；Kq為猝滅速率常數；τ0為無ACN存在時熒光分子的平均壽命，一般τ0約為10-8s[16]。

作出F0/F-[Q]關系圖并計算出不同溫度下的靜態(tài)猝滅常數Ksv，結果如圖1和表1。隨著ACN的加入，BSA熒光強度減小，BSA的最大發(fā)射波長發(fā)生微小藍移，表明ACN對BSA的內源熒光有明顯的猝滅作用，說明ACN與BSA發(fā)生了結合作用使其構象發(fā)生改變。隨著溫度的升高，猝滅常數Ksv減小，表明ACN與BSA的熒光猝滅類型屬于靜態(tài)猝滅。

圖1 ACN與BSA作用的熒光猝滅圖（A，298 K）和Stern-Volmer曲線（B）Fig.1 Fluorescence spectra (A，298 K) and Stern-Volmer curve(B) of interaction between ACN and BSA

表1 不同溫度下ACN與BSA作用的Stern-Volmer猝滅常數Table 1 Stern-Volmer quenching constants of interaction between ACN and BSA at different temperatures

2.1.1.2 ACN對BSA結合常數和結合位點數的計算

式（2）中：F0、F分別為未加入和已加入ACN時BSA的熒光強度；[Q]為ACN的濃度；Ka為結合常數；n為結合位點數。

作出lg[(F0-F)/F]-lg[Q]關系圖并計算出不同溫度下的結合常數Ka和結合位點數n，結果如圖2和表2所示。Ka隨溫度升高呈下降趨勢，表明ACN和BSA結合能力不斷降低；n值從1.12增至1.61，總體趨近于1，表明ACN在BSA上主要有一個結合位點。

2.1.1.3 ACN對BSA結合作用力的判定 靜態(tài)猝滅反應的焓變ΔH、熵變ΔS和吉布斯自由能變ΔG可通過不同溫度下ACN與BSA作用的靜態(tài)猝滅常數Ksv求出。假設該反應的焓變ΔH不隨溫度的改變而改變，故熱力學參數可采用以下方程計算[18]：

圖2 不同溫度下ACN與BSA作用的結合常數擬合圖Fig.2 Fitting diagram of binding constants of interaction between ACN and BSA at different temperatures

表2 不同溫度下ACN與BSA作用的結合常數Ka和結合位點數nTable 2 The binding constants Ka and the number of binding sites n for the interaction between ACN and BSA at different temperatures

式（3）中：R為氣體摩爾常數，8.31 J·mol-1·K-1；Ka為結合常數。

結合Ross和Subramanian利用小分子與蛋白質反應的熱力學參數的變化判斷其作用力類型的規(guī)律[19-20]，由表3可知，ΔH＞0，ΔS＞0時結合作用力是疏水作用力，即ACN進入BSA的疏水空腔內部是利用疏水作用力完成的，進而形成較穩(wěn)定的配合物。結合猝滅反應的ΔG＜0和ΔH＞0，說明該反應自發(fā)正向進行。

表3 ACN與BSA相互作用的熱力學參數Table 3 Thermodynamic parameters of the interaction between ACN and BSA

2.1.1.4 ACN與BSA結合距離的計算 根據Forster偶極-偶極非輻射能量轉移機理及下列關系式[11]：

式（5）中：F0是熒光發(fā)射強度，F是熒光發(fā)射體與熒光受體濃度比為1:1時的熒光強度，R0為臨界轉移能量距離，r為花青素與BSA結合時結合位置處BSA分子中熒光發(fā)射基團之間的距離；式（6）中，K、N、φ、J分別表示偶極空間取向因子、介質的折射常數、BSA的熒光量子產率、BSA的熒光發(fā)射譜與花青素的吸收光譜的重疊積分；式（7）中：F（λ）是BSA在波長λ處的熒光強度，ε（λ）是花青素在波長λ處的摩爾吸光系數。

在進行非輻射能量轉移效率及結合距離的計算時，J值是通過實驗濃度條件下猝滅劑ACN紫外譜和熒光體BSA的熒光譜重疊獲得（如圖3中陰影部分面積）。根據Forster能量轉移理論公式可以確定，K2、N-4、φ分別取1.5、1.36、0.15，ACN與BSA間的能量轉移效率E為9.43%，轉移效率為50%時的臨界距離R0為1 nm，ACN與BSA的結合距離為1 nm，小于7 nm，說明二者發(fā)生了非輻射能量轉移[21]。

圖3 BSA的熒光光譜與ACN的紫外吸收光譜重疊圖Fig.3 Overlapping absorbance spectra of ACN and fluorescence spectra of BSA

2.1.2 同步熒光分析 BSA分子中的酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸能產生熒光，但BSA的熒光強度主要取決于色氨酸殘基。蛋白質的熒光強度與其氨基酸殘基所處環(huán)境的極性密切相關，在蛋白質的同步熒光光譜中，Δλ=15 nm表示的是酪氨酸殘基的光譜性質，Δλ=60 nm表示的是色氨酸殘基的光譜性質[6]。由圖4可知，隨著ACN濃度的增加，BSA熒光強度均下降，酪氨酸的熒光發(fā)射峰的位置紅移了2 nm，色氨酸的熒光發(fā)射峰的位置藍移了6 nm，表明ACN受到酪氨酸殘基的影響作用很小，主要受到色氨酸殘基的影響，則ACN與BSA的結合位點主要是色氨酸殘基。

2.1.3 位點競爭分析 朱國飛等[21]通過研究發(fā)現，布洛芬和華法林的結合位點主要是site II和site I，本實驗分別采用布洛芬和華法林作為位點競爭探針，進一步確定ACN在BSA上的結合位點。

由式（2）計算得知，無位點探針時結合常數為0.13，加入布洛芬后結合常數為0.084，加入華法林后結合常數為0.062。結合圖5可知，加入華法林后結合常數降低的幅度比加入布洛芬的大，說明華法林探針對ACN與BSA作用的影響效果更強，表明ACN與BSA結合位點是在site I。

圖4 ACN與BSA相互作用的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous luorescence spectroscopy of the interaction between CAN and BSA

圖5 在不同探針下ACN與BSA相互作用圖Fig.5 Interaction diagram of ACN and BSA under different probes

2.2 紫外-可見吸收光譜分析

在小分子與蛋白質相互作用的研究中，紫外-可見吸收光譜是常用的研究方法。BSA與不同濃度的ACN作用后的紫外吸收光譜圖如圖6所示。

由圖6可知，278 nm處的吸收峰是由BSA分子上的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環(huán)π-π*躍遷引起的[22-23]，隨著ACN濃度的增加，BSA在278 nm處的吸收峰強度降低，同時伴隨著微小紅移，表明ACN的加入使BSA的構象發(fā)生了變化，進一步證明了ACN和BSA的作用類型以靜態(tài)猝滅為主。

圖6 BSA與ACN相互作用的紫外-可見吸收光譜Fig.6 UV-Vis absorption spectra of interaction between BSA and ACN

2.3 圓二色譜分析

為進一步研究ACN對BSA構象的影響，運用圓二色譜進行分析，ACN與BSA作用結果如圖7所示。

由圖7可知，BSA分子在208和222 nm處具有負峰，這是α-螺旋結構的特征吸收峰[23]，隨著加入ACN濃度的升高，這兩處的負峰所表示的摩爾橢圓率降低，表明ACN與BSA結合破壞了其分子內氫鍵[24]，根據儀器自帶的CDNN計算軟件可知，隨著ACN濃度的增大，α-螺旋含量降低了3.1%，β-折疊含量增加了0.6%，疏水性降低，無規(guī)則卷曲含量降低了1.0%，推測ACN的加入使BSA分子的生理結構發(fā)生了改變，所以發(fā)生了猝滅現象。

圖7 ACN與BSA作用的圓二色譜圖Fig.7 Circular dichroic diagram of ACN and BSA

2.4 紅外光譜分析

紅外光譜可以明確提供蛋白質各二級結構含量的詳細數據，因而被廣泛應用于蛋白質結構研究。與蛋白質二級結構密切相關的有酰胺Ⅰ帶（1600～1700 cm-1）和酰胺Ⅱ帶（1500～1600 cm-1）[25-27]。酰胺Ⅰ帶主要由C=O鍵伸縮振動引起，而酰胺Ⅱ帶由C-N的伸縮振動和N-H的彎曲振動造成，其中酰胺Ⅰ帶的研究價值更高[28]。

由于C=O雙鍵的存在，ACN與BSA中都含有酰胺Ⅰ帶。由圖8可知，加入ACN后，BSA的酰胺Ⅰ帶由1636.4 cm-1藍移到1637.3 cm-1，酰胺Ⅱ帶改變不明顯。所以隨著ACN濃度增加，酰胺Ⅰ帶的改變更明顯，進一步證明ACN與BSA發(fā)生相互作用并對BSA的二級結構產生了影響。

圖8 ACN對BSA紅外光譜的影響Fig.8 Influence of ACN on BSA by infrared spectrum

3 結論

本實驗在模擬生理環(huán)境的情況下，研究ACN與BSA結合機理及對BSA生理功能的影響。結果表明：ACN對BSA的猝滅類型是靜態(tài)猝滅，計算得到的熱力學參數說明二者間作用力類型是疏水作用力，反應過程自發(fā)進行。ACN與BSA結合位點數約為1，位于site I，此位點更接近于色氨酸殘基，ACN的加入引起B(yǎng)SA中酪氨酸殘基、色氨酸殘基所處的環(huán)境極性增強，從而改變了BSA的二級結構，使BSA的功能構象發(fā)生變化。本研究為ACN在醫(yī)藥、食品及化妝品工業(yè)的發(fā)展提供了可靠的科學依據和實際參考價值。然而，本研究僅對ACN與BSA的作用機理進行了探討，ACN的穩(wěn)定性及吸收效果還需進一步研究。