基因共表達對人源LysoPLD異源可溶性表達、純化及酶學性質的影響

馬文君，滕 琳，王培培，衛宏遠，鄭春陽

（1.天津大學，天津 300350；2.天津強微特生物科技有限公司，天津 300384；3.守正創新生物科技（天津）有限公司，天津 300384）

磷脂酶是催化磷脂水解的第一步關鍵酶，根據水解磷脂的部位不同可以把磷脂酶分為磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶 B、磷脂酶C和磷脂酶D[1]。磷脂酶D（PLD）是一個復雜的蛋白家族，普遍存在于哺乳動物、植物和細菌中[2-3]。磷脂酶D能夠水解細胞膜中的磷脂，其水解產物參與細胞的多種生理過程如抗凋亡、傷口愈合、促進血管生成、神經系統發育、腫瘤進展等[4-5]。人溶血磷脂酶D（LysoPLD）因其與PLD的氨基酸序列具有相似性，也具有磷脂酶活性。作為PLD家族一員，它不僅可以水解溶血磷脂分子中磷酸二酯鍵生成溶血磷脂酸（LPA）和一個自由的頭部基團，還能夠催化磷脂和某些醇類發生堿基交換反應生成另一種磷脂[6-8]。

在食品工業中，PLD廣泛作用于多種磷脂，以卵磷脂為底物，富集自然界稀少、難以分離提純的單體磷脂，如磷脂酰絲氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰甘油（PG）等，這些磷脂都具有非常高的經濟價值[9-11]。如磷脂酰絲氨酸，是一種新資源食品，具有改善阿爾茲海默癥、治療抑郁癥和緩解精神壓力等作用，市場前景十分廣闊[12-13]。酶法合成磷脂酰絲氨酸主要取決于PLD催化作用，但市售的PLD主要是從植物中提取，存在的問題主要是種類少、活力低、價格高。鑒于LysoPLD的PLD活性及其人源的低免疫原性，采用微生物異源表達LysoPLD具有解決市售PLD存在問題的潛力。

如何提升外源蛋白高效、可溶表達一直是工業酶生產與應用的瓶頸。目前，多個課題組嘗試了磷脂酶D的異源表達，大多呈包涵體表達[14-15]。由于蛋白表達速度過快、活性二硫鍵來不及正確配對等原因，外源蛋白在大腸桿菌胞內往往會以無活性的包涵體形式表達。由于包涵體復性折疊機制不明確，把無活性的包涵體復性為完全的天然活性狀態不僅操作繁瑣而且復性效率較低。較低的復性效率依然是大腸桿菌體系表達的許多外源蛋白造成損失或者難以有效制備的主要原因[16]。原核表達系統及可溶性表達優化確實均屬于非常成熟的技術，但在重組蛋白的表達過程中，合適的載體和分子伴侶對重組蛋白的正確折疊，防止包涵體的形成具有積極作用[17]。因此在實踐過程中需要對不同標簽蛋白和分子伴侶進行大量的篩選研究，確定合適的促溶表達條件。本研究首次嘗試用觸發因子（Triggering factor，Tig），作為第一個與新生多肽鏈相互作用的伴侶分子，以期協助LysoPLD蛋白共翻譯折疊，有效促進其可溶表達。

前人通過定點突變研究發現，LysoPLD的活性中心（LysoPLD催化結構域）位于胞外結構域的Thr-210到His-475序列附近[18]，確定含有Ser 48的C末端的胞外結構域是LysoPLD的主體，可以獲得可溶、具有活性的重組分子[19]。在此基礎上，本研究在大腸桿菌中分別構建含促溶標簽MBP和分子伴侶tig共表達兩種促LysoPLD可溶表達體系，并研究了兩種促溶體系對重組蛋白的可溶表達、純化方法、酶活性等方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株和質粒大腸桿菌Escherichia coliDH5α、Escherichia coliBL21（DE3） 均由本實驗室保存；pET28a-MBP質粒 由本實驗保存；Chaperone Competent Cells pTf16/BL21 Takara公司；pET28a-MBPPLD 本實驗構建；限制性內切酶 美國NEB公司；膠回收試劑盒 美國Promega公司；質粒小提試劑盒 中國天根生物公司；SDS-PAGE電泳凝膠試劑盒、高保真PCR聚合酶 天津強微特生物科技有限公司；實驗所用純化填料 美國GE公司；麥芽糖等其他試劑 為國產分析純。

AKTApurifier TM100純化系統 美國GE公司；SCIE10TI-IID超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Bio-radPowerPac HV垂直電泳儀 美國Bio-Rad公司；BioDoc-It2 315 Imaging System凝膠成像系統 美國UVP公司；GL-21M高速冷凍離心機 中國湘儀公司；UV3100紫外可見光分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人源LysoPLD基因的克隆及載體構建 根據NCBI上人LysoPLD（ENPP2）基因編碼的氨基酸序列信息及催化反應的信息，確定本實驗的目的克隆序列。通過信號肽分析程序（http://www.detaibio.com/tools /index.php?r=signal-peptide/index）對此序列進行信號肽分析，確定Ser-48至C末端全序列為本研究的目的基因序列。經密碼子優化后，由通用生物合成目的基因序列，獲得質粒pET28a-LysoPLD質粒。通過Snapgene設計麥芽糖結合蛋白（MBP）上下游引物，將MBP作為促溶標簽與人LysoPLD基因融合表達，上游引物P1：5’-GTTTAACTTTAAG AAGGAGATATACC atgaaaatcgaagaaggtaaactg；下游引物P2：5’-AATATTGGTCCACGGACTCATATT GGATTGGAAGTACAGGTTTTCCTCGATCCCagt ctgcgcgtctttcagggc；設計用于擴增pET28a-LysoPLD骨架的引物，上游引物P3：5’-ATGAGTCCGTGGA CCAATATTAG；下游引物P4：5’-GGTATATCTCC TTCTTAAAGTTAAAC。

首先以P1、P2為引物對，PCR擴增MBP基因片段，再以P3、P4為引物對，PCR擴增pET28a-LysoPLD骨架，PCR的擴增條件為：98 ℃，3 min；（98 ℃，10 s；60 ℃，30 s；72 ℃，3.5 min） × 30循環；72 ℃，7 min；4 ℃，∞。將得到片段采用膠回收試劑盒進行片段回收，回收的片段以摩爾比1:3（MBP片段的摩爾數＞pET28a-LysoPLD骨架的摩爾數）于室溫采用同源重組的方法連接1 h，連接產物轉化E.coliDH5α感受態，篩選陽性克隆，并進行測序鑒定。經鑒定的重組表達載體為pET28a-MBPLysoPLD，轉化E.coliBL21（DE3）感受態細胞后于-80 ℃進行保存[20]。

1.2.2 MBP-LysoPLD的誘導表達及條件優化 將-80 ℃保藏的重組表達菌株pET28a-MBP-PLDBL21（DE3）復蘇后，接種于5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養基中，37 ℃，100 r/min振蕩過夜活化。將活化的pET28a-MBP-PLD-BL21（DE3）繼續擴大培養，接種于100 mL含有卡那霉素的LB液體培養基中，當菌液A600達0.5～0.7時，加入IPTG誘導表達。6000 × g離心10 min收集菌體，超聲破菌后，離心得到菌液上清和沉淀，再用0.5 mmol/L Tris-HCl將沉淀復溶，進行SDS-PAGE分析，配制10%分離膠和5%濃縮膠，恒定功率10 W跑45 min[21]。

1.2.3 Tig分子伴侶與PLD共表達實驗 Takara公司的pTf16質粒中存在tig表達基因，受araB啟動子調控，pET28a-LysoPLD質粒中目的基因LysoPLD受Lac調控系統控制，兩個質粒具有不同的抗生素標記可進行共表達，且tig和LysoPLD可獨立誘導表達[22]。將pET28a-LysoPLD和pTf16兩個質粒同時轉化BL21（DE3），采用雙抗LB培養基（25 μg/mL卡那霉素和17 μg/mL氯霉素）篩選同時具有兩種質粒的轉化子，-80 ℃凍存。取出轉化子，接種到雙抗培養基中，37 ℃振蕩培養活化；活化后，接種于100 mL含雙抗和0.5 mg/mL L-Arabinose的LB培養基中進行擴大培養（此時已開始表達Tig），當A600達0.4～0.6時，于15 ℃放置30 min，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG于15 ℃振蕩培養12～24 h。培養結束后，6000×g離心10 min收集菌體，超聲破菌，根據SDS-PAGE電泳（具體方法同1.2.2）、活性測定結果確認目的產物的表達量及溶解性。

1.2.4 重組LysoPLD的純化 MBP-LysoPLD的純化：將誘導后收集的pET28a-MBP-LysoPLD的BL21（DE3）菌體均勻懸浮于50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液中，經超聲破菌后，20000×g離心20 min，收集上清，經0.45 μm濾膜過濾后，采用Amylose親和柱進行純化。采用Amylose-A（20 mmol/L Tris-HCl pH7.4，1 mmol/L EDTA，0.2 mol/L NaCl）進行洗滌、平衡，得到流穿蛋白，采用Amylose-B（20mmol/L Tris-HCl pH7.4，1 mmol/L EDTA，0.2 mol/LNaCl，10 mmol/L麥芽糖）進行洗脫，收集洗脫組分，得到洗脫收集蛋白，進行10%SDS-PAGE分析，具體方法同1.2.2。

LysoPLD（tig）的純化：將誘導后收集的同時含有pTf16(tig)和pET28a-LysoPLD的BL21（DE3）菌體，均勻懸浮于50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液中，經超聲破碎后，20000×g離心20 min，收集上清，過0.45 μm濾膜。首先采用SP柱，經SP-A（20 mmol/L Tris-HCl（pH6.0））洗滌后，得到流穿蛋白。采用SPB（20 mmol/L Tris-HCl（pH6.0），1 mol/L NaCl）進行洗脫，洗脫流速為1 mL/min，洗脫梯度為0～100%B，10 min收集洗脫組分，得到洗脫收集蛋白。再過Q柱純化，經Q-A Buffer（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA，5%Glycerol）洗滌后，得到流穿蛋白，采用Q-B Buffer（20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA，5%Glycerol，1 mmol/L NaCl）進行洗脫，收集洗脫組分，得到洗脫收集蛋白，將上述得到的蛋白進行10%SDS-PAGE分析，具體方法同1.2.2。

1.2.5 LysoPLD的酶活測定 LysoPLD的酶活測定方法參考對硝基苯酚方法[23]，對硝基苯酚粉末用50 mmol/L Tris-HCl （pH8.0）進行溶解并稀釋，溶液濃度梯度為0、0.005、0.01、0.02和0.04 μmol/L，并測定其在波長為405 nm的分光光度值擬合得到對應標準曲線為y=28.36x，R2=0.9991。

取30 mg對硝基酚棕櫚酸酯溶于10 mL異丙醇后，用含10% Triton-100的Tris-HCl(pH8.0)的溶液混合溶解，放入37 ℃恒溫水浴5 min，加入適量酶液，測定405 nm處紫外分光光度值隨時間變化的曲線，算出每分鐘吸光值的值，酶水解活力計算公式為：

式中，△A為酶促反應的吸光變化值；V為測量試樣總體積；Vs為所加酶液體積；K為對硝基酚標準曲線斜率；T為反應時間；277為轉化系數。

1.2.6 最適溫度、最適離子濃度和最適pH 將重組酶置于含有50 mmol/L CaCl2的40 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）中，在20～80 °C溫度范圍內，每間隔10 °C進行酶反應，研究溫度對重組酶活性的影響。

將50 μL20 mmol/L的重組酶添加到含有底物和100 μL 10、50和100 mmol/L不同金屬離子（Zn2+、Ca2+和Mg2+）的溶液中后測量活性。另外，以40 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）溶液為緩沖液進行對照。通過將不同因素的酶活性除以對照組的100%，計算出重組酶的相對活性（%）。

參照侯海娟等的方法，將純化得到的兩種磷脂酶D（10 μL）在50 °C下預孵育30 min，以含有對硝基酚棕櫚酸酯的反應混合物為底物，以40 μL不同pH（5.0～8.5）緩沖液100 mmol/L乙酸鹽、50 mmol/L三氯化甘油和8 mmol/L CaCl2作為緩沖液進行反應。

將20 mmol/L 50 μL的重組酶添加到含有底物對硝基酚棕櫚酸酯和不同濃度（0、10、25、45和100mmol/L）Ca2+離子（100 μL）的溶液中后測量活性。另外，以Triton X-100溶液為緩沖液進行對照。通過將不同因素的酶活性除以對照組的100%，計算出重組酶的相對活性（%）。

1.3 數據處理

實驗中每個處理重復3次，采用SPSS 22.0軟件進行數據顯著性分析，應用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 pET28a-LysoPLD和pET28a-MBP-LysoPLD質粒的構建與鑒定

根據前述方法，通過PCR分別擴增MBP片段（～1100 bp，圖1A）和pET28a-LysoPLD骨架（～7700 bp，圖1B），同源重組后，獲得的質粒采用T7/T7t引物對，對轉化子進行PCR擴增鑒定，并采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，出現～3500 bp的擴增產物，其大小恰好與MBP（～1100 bp） + LysoPLD（～2400 bp）大小相吻合（圖1C）。重組質粒經抽提測序，BLAST比對，與目的基因序列相符，未發生突變，表明pET28a-MBP-LysoPLD載體構建成功。

圖1 MBP基因、pET28a-LysoPLD載體骨架和pET28a-MBP-LysoPLD基因的PCR擴增電泳圖Fig.1 PCR amplification and identification of MBP gene、pET28a-LysoPLD and pET28a-MBP-LysoPLD

2.2 pET28a-MBP-LysoPLD-BL21（DE3）的誘導表達分析

分別培養pET28a-LysoPLD-BL21（DE3）和pET28a-MBP-LysoPLD-BL21（DE3），并經IPTG誘導，收集菌體，超聲破菌，進行SDS-PAGE電泳檢測。如圖2A可以看出，誘導后的全菌在110 kDa處有一明顯蛋白質條帶，但上清中卻并未發現此蛋白的表達（圖2A，泳道3），都在沉淀中（圖2A，泳道4），證明沒有MBP標簽的LysoPLD蛋白幾乎全部呈包涵體表達。MBP是一種大腸桿菌的內源性的蛋白質，由大腸桿菌K12的malE基因編碼，分子量為40 kDa[24]，在大腸桿菌中具有極高的表達量。在目的蛋白的氨基端添加MBP標簽蛋白時，可大幅度地提高目的蛋白的可溶性表達量，并且可幫助目的蛋白在大腸桿菌中正確折疊并保持原有的活性[25]。因此。本實驗構建了pET28a-MBP-LysoPLD，將LysoPLD蛋白與MBP進行融合表達，融合蛋白MBP-LysoPLD分子量大于116 kDa紅色箭頭標示的條帶，由圖2B顯示，大約1/3的MBP-LysoPLD可在誘導表達后超聲破碎離心得到的上清中表達（圖2B，泳道4）。后續通過發酵工藝的優化，目的蛋白質的可溶表達量可能會有進一步的提高。

圖2 大腸桿菌表達的重組PLD和MBP-LysoPLD的SDS-PAGE分析Fig.2 Analysis of the recombinant of LysoPLD and MBP-LysoPLD expressed in E. coli by SDS-PAGE

2.3 Tig與LysoPLD的共誘導表達分析

鑒于LysoPLD的原核表達主要以包涵體形式存在，除了用促溶標簽的方法，本實驗還嘗試了共表達分子伴侶Tig的方法。如圖3所示，在加入IPTG誘導前（圖3，條帶1）就已經在50 kDa左右出現了tig的誘導表達條帶，在加入IPTG后，在66.2～116 kDa區間出現LysoPLD目的蛋白（圖3，條帶2），部分呈上清表達（圖3，條帶3），部分在破菌后離心沉淀中，即呈包涵體表達（圖3，條帶4），包涵體蛋白沒有經過正確折疊的聚集體，不具備其應有的生物活性。對比SDS-PAGE圖2B第4條泳道和圖3中第3條泳道破菌離心的上清結果得到的可溶蛋白量大于促溶標簽法。tig分子伴侶促溶法在誘導表達操作上較復雜，但經誘導表達后可直接獲得LysoPLD蛋白本身。而促溶標簽法誘導表達的是融合蛋白，后續需要把促溶標簽通過蛋白酶進行切除后再純化。

圖3 大腸桿菌表達的重組LysoPLD（tig）的SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of the recombinant of pTf16-LysoPLD（tig）expressed in E.coli by SDS-PAGE

2.4 LysoPLD（tig）和MBP-LysoPLD的分離純化比較分析

根據MBP標簽特性，本實驗采用了Amylose親和柱層析對MBP-LysoPLD融合蛋白的純化，目標蛋白條帶大于116 kDa，對Amylose親和柱吸附特異性強，可以被洗脫，結果如圖4箭頭所示，最終條帶3為目標蛋白MBP-LysoPLD，所得最終樣品約4 mL，濃度0.46 mg/mL，根據凝膠成像分析系統分析其純度達到90%以上。

圖4 Amylose Resin純化洗脫MBP-LysoPLDFig.4 Purification and elution of MBP-LysoPLD by Amylose Resin

tig協助下的LysoPLD蛋白表達菌株經超聲破碎，細胞上清液依次經過SP瓊脂糖凝膠柱（圖5A）和陰離子Q柱（圖5B），進行目的蛋白洗脫，最終獲得分子量為110 kDa的目標蛋白（圖5B）。在設計LysoPLD的表達時，PLD序列設計了His標簽，但無論His標簽在C端或在N端，PLD蛋白都無法掛Ni柱（結果未示出），因此采用離子交換柱Q柱進行PLD蛋白的純化，根據凝膠成像分析系統分析其純度達到80%以上。

比較tig協助下的LysoPLD蛋白和融合蛋白MBP-LysoPLD的分離純化步驟發現，MBP-LysoPLD由于存在MBP標簽，只采用Amylose親和層析就可以得到純度在90%的融合蛋白，但后續也會涉及采用TEV進行MBP標簽切割步驟；而tig協助下的LysoPLD蛋白由于不能掛Ni柱純化，需要進行兩步離子柱洗脫，在操作方法上來講較為復雜，但不需要再進一步切除多余的標簽。因此，從純化步驟的角度兩種方法復雜度類似。

圖5 蛋白純化后的SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified PLD protein

2.5 LysoPLD（tig）與MBP-LysoPLD的酶活比較分析

采用同樣100 mL發酵液體積，MBPLysoPLD融合蛋白得到4.91 mg，tig協助折疊的LysoPLD蛋白得到5.79 mg，tig協助的PLD蛋白比融合蛋白MBP-PLD得率約高17.9%。根據1.2.5中的酶活測定方法，分別測定融合蛋白MBPLysoPLD和tig協助折疊的PLD的酶活力，MBPLysoPLD的總活力為20.98 U，比活力為4.27 U/mg，LysoPLD（tig）總活力為42.61 U，比活力為7.32 U/mg（表1）。

表1 兩種LysoPLD酶活性質比較Table 1 Comparison of two LysoPLD enzyme activity

目前報道的LysoPLD蛋白的表達系統有Sf 9昆蟲細胞和COS-7細胞表達[19]，現有結果表明這兩類表達系統表達的蛋白缺乏修飾，蛋白表達量低，無法滿足LysoPLD蛋白結構及功能研究，也有研究者對LysoPLD蛋白進行HEK293細胞的規模化表達，但其表達的LysoPLD蛋白含有FC標簽，標簽較大，后續需要切去標簽，獲得蛋白純度低[26]。本試驗構建的LysoPLD（tig）可以有效避免切標簽帶來的操作，與其他來源的標簽相比，表達效率高，可溶性效果好，具有重要的應用價值。

2.6 pH、溫度及金屬離子對LysoPLD酶活的影響比較

圖6（A）表明LysoPLD在pH為5.5，鈣離子濃度為50 mmol/L時，其相對酶活的最適溫度為40 ℃。溫度達到60 ℃仍保留50%的酶活力，高于60 ℃時活性降低并逐漸消失。故LysoPLD的溫度耐受范圍在20～60 ℃。不同濃度的金屬離子處理LysoPLD蛋白，檢測其對LysoPLD活性影響(圖6B)可知，不同金屬離子明顯影響重組酶的活性，且呈現濃度依賴性，尤其是50 mmol/L鈣離子時，重組酶活性最高，與重組酶有Ca2+的結合位點有關，與相關文獻的研究結果一致[27]。

LysoPLD的酶催化功能依賴于Ca2+離子，同時pH對其酶活的影響也很大，因此，本研究對比了LysoPLD（tig）和MBP-LysoPLD在Ca2+離子依賴性及最佳pH方面的特性[28]（圖7）。結果發現，兩種LysoPLD均呈現顯著Ca2+的依賴性。隨著pH的提高，在不同鈣離子濃度作用下，兩種PLD的相對酶活均呈現先增高后降低，且LysoPLD（tig）和MBPLysoPLD二者的最佳pH都在5.5～5.6之間，最佳酶活時需要的鈣離子濃度是45 mmol/L。因此，通過PLD（tig）及MBP-LysoPLD蛋白的酶活特性比較分析可以發現，在最適pH和最適鈣離子濃度條件下，兩種酶的相對酶活均達到90%以上，因此，促溶標簽法和tig共表達方法都可獲得發揮正常功能，具有一致特性的LysoPLD。

圖6 LysoPLD（tig）與MBP-LysoPLD在不同溫度相對酶活（A）和LysoPLD（tig）在不同金屬離子下相對酶活（B）Fig.6 Relative enzyme activities of LysoPLD (tig) and MBP-LysoPLD at different temperature (A) and LysoPLD (tig)at different metal ions (B)

圖7 PLD（tig）與MBP-LysoPLD在不同pH和濃度Ca2+下相對酶活Fig.7 Relative enzyme activities of LysoPLD (tig) and MBP-LysoPLD at different pH and Ca2+ concentration

3 結論

成功構建了人PLD的原核表達質粒pET28apTf16-LysoPLD（tig）和pET28a-MBP-LysoPLD，建立了LysoPLD（tig）和MBP-LysoPLD蛋白大腸桿菌促進可溶性表達系統，獲得了純度80%以上的LysoPLD蛋白。兩種LysoPLD酶反應最適pH在5.5～5.6之間，最佳酶活時需要的鈣離子濃度是45 mmol/L，兩種促進可溶性表達方式都可以獲得具有一致特性的LysoPLD。