外源抑制物對風干腸微生物群落組成變化的影響

陳援援，于德陽，秦建鵬，馬儷珍

（天津農學院食品科學與生物工程學院，天津 300384）

風干腸是在適宜的條件下進行風干成熟而制成的一類自然發酵肉制品，因為在風干過程中水分活度和pH逐漸降低，加之優勢微生物的競爭作用，所以能抑制產品中有害微生物的生長繁殖，使產品具有營養豐富、色澤美觀、風味獨特、保質期長等特點，深受北方消費者的青睞[1-3]。

目前，我國風干腸的生產仍然存在一些不容小覷的問題，如傳統風干腸的加工是采用自然發酵方式，生產周期長，微生物來源復雜，易受微生物污染而腐敗變質，使產品質量不能得到很好的控制，而工業化生產為了提高風干腸的生產效率，使用快速風干成熟法，使風干腸失去了原有的獨特發酵風味[4-5]。因此使用天然抑菌劑，研究風干腸在自然發酵過程中微生物數量動態變化及微生物群落結構組成對于實現風干腸發酵過程的人工控制和工業化生產，提高其安全品質具有重要意義[6-8]。風干腸中的主要微生物有細菌、霉菌和酵母[9]。Hu等[10]采用高通量測序技術對東北5個不同地區的風干香腸的細菌群落結構進行了測定，結果表明：硬壁菌和蛋白菌是優勢菌門，乳酸桿菌、葡萄球菌、明串珠菌、乳球菌和魏氏菌是優勢菌屬，木糖葡萄球菌、清酒乳酸桿菌、希臘魏氏菌、檸檬明串珠菌、棉子糖乳球菌和植物乳桿菌為主要優勢菌種。Chen等[11]研究表明乳酸桿菌和葡萄球菌是影響哈爾濱干香腸品質的優勢菌。本實驗室前期將已優選的復合抗氧化劑（Compound antioxidants,CA）、復合香辛料（Compound spice，CS）、發酵牛骨調味基料（Fermented beef flavorings，FBF）及其組合應用到風干腸的加工中，研究了其對產品的風味、生物胺、N-亞硝胺以及脂肪氧化等相關理化指標的影響，發現這些外源抑制物有一定的提高產品風味和安全品質的作用[12-14]。本研究在此基礎上，進一步研究這些外源抑制物對風干腸在風干過程中的細菌總數、乳酸菌數、腸桿菌科菌數的變化，并通過16S rDNA高通量測序分析等儀器手段，分析風干終點（12 d）產品的微生物群落組成變化，比較幾種外源抑制物對風干腸微生物安全性的影響，以期為風干腸的加工工藝提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬后腿肉（冷卻肉）、豬肥膘 天津市康寧肉制品有限公司；食鹽、白沙糖、曲酒、味精、醬油、葡萄糖、木糖 天津市紅旗農貿批發市場；冷凍牛骨肉末（骨肉比為3:7） 天津掛月食品有限公司；胡椒精油、姜油、花椒精油、八角精油、丁香精油 頂興（天津）食品科技發展有限公司；茶多酚、迷迭香 豫中生物科技有限公司；VE、Vc、VB1蘇州佰億鑫生物科技有限公司；VHI-41（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌） 意大利薩科公司；風味蛋白酶（酶活力500 LAPU/g）、復合蛋白酶（酶活力1.5 AU/g）丹麥諾維信公司；L-半胱氨酸、丙氨酸、甘氨酸 冀州市華陽化工有限責任公司；人工膠原蛋白腸衣（牛二層皮提取、孔徑30 mm） 神冠控股（集團）有限公司（以上材料均為食品級）；MRS培養基、營養瓊脂、結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂 青島高科技工業園海博生物科技有限公司。

SX-500高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMY有限公司；CLIMACELL恒溫恒濕箱、Friocell 22恒溫恒濕培養箱 艾力特國際貿易有限公司；BVBJ-30F真空攪拌機 浙江嘉興艾博實業有限公司；XZ-5L灌腸機 廣州旭眾食品機械有限公司；CLASSⅡ生物安全柜 天美（中國）科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 風干腸的制作 參照李木子等[15]的方法。

1.2.2 幾組外源抑制物的配制方法

1.2.2.1 CA的配比 按照熊鳳嬌等[12]的研究結果，以每組的總肉量計，依次添加茶多酚60.14 mg/kg、迷迭香60.11 mg/kg、VE60.00 mg/kg和抗壞血酸鈉60.00 mg/kg。

1.2.2.2 CS的配比 按照陳文靜等[16]的研究結果，以每組的總肉量計，依次添加胡椒精油、姜油、花椒精油、八角精油、丁香精油的含量分別為2.08、3.12、3.69、2.83、0.22 mL/kg。

1.2.2.3 FBF的制備 參照樊曉盼等[17]的方法。

1.2.3 試驗設計方案 按照1.2.1風干腸的制作方法制作出6組風干腸，CK（Control group，CK）組作為空白對照組，風干腸的原輔料配比同1.2.1，其它5組風干腸均是在CK組的基礎上添加不同種類的外源抑制物，其中CA和CS分別按照1.2.2.1和1.2.2.2的比例添加，FBF按照原料肉重的2%比例添加。具體試驗設計方案見表1所示。各組分別在風干成熟過程的第1、3、6、9、12 d取樣，進行菌落總數、乳酸菌數、腸桿菌科菌數的測定；取6組風干腸成品（風干成熟第12 d）進行微生物多樣性分析。

表1 試驗設計方案Table 1 Scheme of experiment design

1.3 指標測定方法

1.3.1 乳酸菌總數 按GB 4789.35-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[18]6.2.3.4乳桿菌計數方法執行。

1.3.2 菌落總數 按GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》[19]方法進行檢測。

1.3.3 腸桿菌科總數 按GB 4789.41-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗腸桿菌科檢驗》[20]執行。

1.3.4 微生物多樣性分析 將6組風干腸成品送到北京奧維森基因科技有限公司，采用擴增子測序方法分析樣品16S rDNA的V3-4區段、細菌群落結構等，對樣品進行細菌多樣性分析[21]，擴增區段引物序列為：GTACTCCTACGGGAGGCAGCA，GTGGAC TACHVGGGTWTCTAAT。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2010軟件計算平均值和標準差，用SPSS軟件進行顯著性分析，Origin 10.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 6組風干腸在風干過程中乳酸菌數、菌落總數和腸桿菌科菌數的變化

6組風干腸在風干過程中乳酸菌數、菌落總數和腸桿菌科菌數的變化見圖1所示。由圖1可以看出，各組樣品的乳酸菌數、菌落總數和腸桿菌科菌數變化趨勢基本一致，在風干前6 d呈升高趨勢隨后緩慢下降，此變化與韋友兵[22]研究薩拉米發酵成熟過程中微生物菌群變化趨勢基本一致。各組的乳酸菌數由風干第1 d的6.00～6.28 lg CFU/g升高到第6 d的8.64～9.18 lg CFU/g再到第12 d的7.33～8.41 lg CFU/g（見圖1A）。菌落總數的變化趨勢，風干第1 d為5.70～6.12 lg CFU/g，風干第6 d達到最大值8.09～8.84 lg CFU/g，然后緩慢降低到風干12 d為7.44～8.33 lg CFU/g（見圖1B），腸桿菌科菌數在風干第6 d達到最大6.90～8.47 lg CFU/g，風干結束時降低到5.40～6.79 lg CFU/g（見圖1C）。各組風干腸之間在風干過程中的菌數未呈現規律性變化，比較6組風干腸之間在風干第12 d的菌數變化，乳酸菌數從高到低依次為：CK＞FBF≈CS≈CA＞CSA＞FBFA，菌落總數從高到低依次為：CK＞FBF＞CS＞CA＞CSA＞FBFA，腸桿菌科菌數從高到低依次為：CK＞CA＞CS＞CSA＞FBFA＞FBF。由此可以看出，添加了外源抑制物的5組試驗組的各種菌數均顯著低于CK組（P＜0.05），特別是FBF組的腸桿菌科數明顯降低，FBFA組的菌落總數為組內最低，說明添加FBF和FBFA對有害微生物有較好的抑制作用。吳晨燕等[23]研究FBF對大腸桿菌的抑菌作用及機理，通過掃描電鏡觀察菌體形態，測定相對電導率了解胞膜通透性時發現，FBF會破壞細胞的正常形態，使菌體表面出現褶皺、孔洞，影響菌體營養物質的正常傳遞和運輸，從而抑制大腸桿菌生長，這對于控制風干腸的安全性有利，因為腸桿菌科細菌屬于條件致病菌[24]。但是，仔細觀察FBF組、FBFA組和CSA組的腸桿菌科數仍高達5.40～5.54 lgCFU/g，瑞士對發酵成熟的生香腸中的腸桿菌科限量值為100 CFU/g[25]。雖然目前我國對發酵成熟的生香腸中的腸桿菌科數沒有限量標準，但為了提高風干腸的品質和安全性，考慮在后期研究中應采用人工接種乳酸菌和天然抗氧化劑，利用優勢菌群等溫和的柵欄技術來控制雜菌的繁殖。

圖1 不同外源抑制物組風干腸在風干過程中乳酸菌總數、菌落總數和腸桿科菌數的變化Fig.1 Changes of total number of lactic acid bacteria, total number of colonies and the number of Enterobacteriaceae in airdried sausages with different exogenous inhibitors

2.2 6組風干腸成品的微生物多樣性指數分析

利用Alpha多樣性指數goods_coverage、chao1、observed species及shannon可進行樣品微生物物種豐富度和多樣性評估[26]。6組風干腸成品的Alpha多樣性指數分析結果見表2所示。由表2可知，6組風干腸成品的測序覆蓋率goods_coverage在99%以上，說明風干腸中未被測到的序列概率很低。CK組的chao1和observed_species指數高于5個試驗組，因為外源抑制物的抑菌成分能夠起到一定的抑菌作用，所以添加了外源抑制物的CA、CS、FBF、FBFA、CSA組的菌群豐度均低于CK組。另外，FBFA組的chao1和observed_species指數達到了組內最低，且shannon指數低于FBF組，說明物種多樣性最低，且FBF與CA復配的抑菌效果優于FBF單獨使用。

表2 6組風干腸成品的Alpha多樣性指數Table 2 Alpha diversity index of 6 groups of air-dried sausages products

2.3 基于門水平的微生物群落結構分析

圖2為6組風干腸成品在門水平上最大豐度排名前5的物種相對豐度所占比例。由圖2可知，6組風干腸成品的微生物群落主要由5個門組成，分別為：厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍藻門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes），各組基于門水平的微生物群落主要是由厚壁菌門和變形菌門組成，占比達到96%以上。進一步分析發現，CSA組、FBF組和FBFA組厚壁菌門所占的比例最大，分別為74.87%、74.51%、68.89%，變形菌門其次，分別為23.82%、22.99%、29.51%；相反，CK組、CA組、CS組變形菌門比例最高分別為60.34%、59.33%、71.64%，其次是厚壁菌門，占比分別為38.14%、39.25%、27.03%。

圖2 6組風干腸成品基于門水平的微生物群落結構組成及相對豐度Fig.2 Composition and relative abundance of microbial community structure based on phylum level in 6 groups of air-dried sausages products

2.4 基于屬水平的微生物群落結構分析

6組風干腸成品基于屬水平的微生物群落結構組成及相對豐度分析結果見圖3所示。由圖3可以看出，除CSA組含有19個屬水平的微生物群落組成，相對豐度為98.91%外，CK組、CA組、CS組、FBF組、FBFA組均包含20個屬，相對豐度分別為99.19%、99.54%、99.17%、98.92%和99.21%，6組風干腸樣品在屬水平的群落結構組成基本一致，均以變形桿菌屬、乳球菌屬、葡萄球菌屬、乳酸桿菌屬、腸球菌屬占主要部分，但相對豐度差異較大，CK、CA、CS組的優勢菌屬為變形桿菌屬，其相對豐度分別為50.89%、55.33%、60.97%，其次為乳球菌屬和葡萄球菌屬；而CSA、FBF、FBFA組的優勢菌屬為乳球菌屬，其相對豐度分別為49.57%、47.46%、40.09%，其次從高到低依次為變形桿菌屬、葡萄球菌屬、乳酸桿菌屬。6組風干腸樣品中乳酸桿菌屬在FBF組中的相對豐度最大（9.08%），FBFA次之（5.24%），腸球菌屬在CK組中的相對豐度最高（5.42%）。由此可以看出，外源抑制物CA、CS、CSA、FBF、FBFA均能影響風干腸中微生物群落結構的相對豐度，值得關注的是，CSA組、FBF組和FBFA組的乳球菌屬為優勢菌，說明這三組更有益于乳酸菌的生長繁殖。在發酵肉制品加工中，常接種乳酸菌發酵劑來形成產品獨特的風味[27]，抑制腐敗菌的生長繁殖，延長保質期[28]，在一定程度上提高了產品的安全性[29-30]。研究表明，乳酸菌在發酵過程中能產生多種抗菌物質和抗氧化產物[31-32]，如Nisin細菌素[33]、乳酸乙酸等有機酸、過氧化氫、乙醇、乙醛、丁二酮等[34]。此外，大部分葡萄球菌對發酵肉制品風味的形成具有明顯的促進作用，因為它們具有蛋白和脂肪水解酶活性，能對蛋氨酸、苯丙氨酸和一些支鏈氨基酸進行降解生成醛、醇和酸等前體風味物質[35-36]。本試驗的6組樣品中葡萄球菌屬豐度的大小關系為FBFA＞CA＞CSA＞FBF＞CK＞CS，這說明將FBF與CA復配添加到風干腸中能提高產品中葡萄球菌屬的相對豐度。

圖3 6組風干腸成品基于屬水平的微生物群落結構組成及相對豐度Fig.3 Composition and relative abundance of microbial community structure based on genus level in 6 groups of air-dried sausages products

3 結論

隨著風干時間的延長，6組風干腸樣品中的微生物數量呈先升高后降低的趨勢，FBFA能有效的控制成熟風干腸的乳酸菌和菌落總數，FBF對腸桿菌科的生長有明顯抑制作用。微生物多樣性分析表明，變形桿菌屬、乳球菌屬、葡萄球菌屬、乳酸桿菌屬和腸球菌屬是風干腸中的主要微生物菌群，其中添加外源抑制物CSA、FBF、FBFA的風干腸有利于乳球菌屬微生物的生長。因此，實驗中篩選出的FBF、FBFA適合作為傳統風干腸的天然抑菌劑，在一定程度上提高了風干腸的食用安全性，為傳統風干腸天然抑菌劑研制提供了一定的實驗基礎。關于該抑菌劑在其他傳發酵肉制品中的應用及與其他菌種結合開發復配抑菌劑還需進一步研究。