紅毛藻多酚提取工藝優化及抗氧化活性

李 月，紀乃茹，李 健，王 力

（集美大學食品與生物工程學院，福建廈門 361021）

紅毛藻（Bangia fusco-purpurea）又名紅毛菜，是一類原始紅藻，屬紅藻門，紅毛菜目，紅毛藻屬。紅毛藻是泛暖溫帶海藻，主要生長在北大西洋亞熱帶海區和溫帶海區以及北太平洋的西部，我國東海和南海沿岸地區是紅毛藻的主產地[1]。紅毛藻味道鮮美，含有豐富的營養成分，如各種氨基酸、糖質、脂肪酸以及Ca、Mg和K等人體必需元素，其中總氨基酸為38.62%、總糖為27%、總脂肪酸為3.77%、鉀為3%[1-3]。有相關文獻記載，紅毛藻有抗氧化[4]、降血壓、滋陰祛火和防治疾病等作用[5]，深受我國南部沿海地區以及東南亞地區消費者的喜愛。福建省莆田市是我國紅毛藻的主要產地之一，每年約有100 t（干重）的產量，每噸紅毛藻價格約10～30萬元，通常被作為食品原料銷售。目前，紅毛藻加工行業存在產品種類單一、附加值低和競爭力弱的問題，開發利用程度較低[6]。

海藻多酚是海藻植物中多酚類化合物的總稱，大多以間苯三酚的衍生物和聚合物的形式存在，是具有拒食功能海藻的次級代謝產物[7]。因其具有抑菌[8-9]、抗氧化[10]、抗癌[11]、降血糖[12-13]及治療肥胖[14-15]等生理活性和藥用功能，常被用于食品、化妝品、藥品及保健品等領域中。抗氧化是海藻多酚的重要生物活性，海藻多酚分子中的酚性羥基能夠切斷氧化過程中產生的過氧化物自由基、羥基自由基的鏈式反應，從而達到抑制和減緩氧化的效果[16]，在食品、化妝品和生物醫藥領域具有重要的開發應用前景。目前國內外對紅毛藻的研究多集中在紅毛藻多糖、藻紅蛋白及其生理學特性，而對關于紅毛藻多酚的相關研究較少，現對紅毛藻中酚類物質的研究僅僅是檢測出紅毛藻多酚含量[17]，而關于紅毛藻中多酚的提取方法和抗氧化能力研究未有相關報道。為充分利用我國豐富的紅毛藻資源，應對其進行較為系統的研究，從而提高紅毛藻資源的利用率。

因此，本論文以干紅毛藻為原料，從其富含的酚類成分的提取工藝優化和抗氧化活性分析入手，采用單因素結合正交試驗優化多酚的提取工藝，并以多酚對1,1-苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）及2,2'-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）的清除率考察紅毛藻多酚的抗氧化活性，旨在獲得紅毛藻多酚的最優化提取工藝，研究紅毛藻的抗氧化活性，為紅毛藻的綜合加工利用奠定前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅毛藻 福建莆田南日鎮人工養殖產品，購于2019年1月；ABTS、DPPH、福林酚、沒食子酸 標準品 上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、無水碳酸鈉、過硫酸鉀、維生素 C（Vitamin C, VC） 分析純，西隴化工股份有限公司。

SB-1100旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司；RE-AA真空冷凍干燥機 美國Thermo公司；SPH-200B恒溫培養振蕩器 上海世平實驗設備有限公司；En Spire2300型酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；H2050R離心機 廈門億辰科技有限公司；DHG-101B型烘箱 佰輝儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅毛藻多酚的提取 將50 ℃恒溫干燥后的紅毛藻粉碎過60目篩，得到紅毛藻藻粉。取1.0 g的藻粉加入一定量的乙醇溶劑，在設定好的溫度下浸提一定時間，再經8000 r/min離心15 min，取上清液測定多酚的提取量。

1.2.2 沒食子酸標準曲線的繪制 以參考文獻方法[18]，以沒食子酸為對照品，采用福林酚法，測定樣品溶液在762 nm波長處的吸光度值，以沒食子酸標準品的濃度X（mg/mL）作為橫坐標、762 nm處測得的吸光值Y為縱坐標，制作標準曲線，得到的回歸方程為

Y=125.79X+0.0564，R2=0.9991。

1.2.3 紅毛藻多酚含量計算 吸取1 mL多酚提取液于具塞試管中，加入1.5 mL福林酚試劑，混勻靜置3 min，隨后加入3 mL 12%的Na2CO3溶液, 定容至10 mL，混勻避光反應2 h，于762 nm測定吸光值。利用標準曲線計算紅毛藻多酚濃度，按下式計算紅毛藻多酚提取量：

式中：C為紅毛藻多酚的濃度，mg/mL；V為多酚提取液總體積，mL；n為稀釋倍數；m為紅毛藻粉質量，g。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 提取時間對多酚提取效果的影響 準確稱取5份1.0 g紅毛藻藻粉，分別置于100 mL的離心管中，固定浸提溫度70 ℃，料液比1:20 g/mL，乙醇體積分數65%，設定浸提時間40、50、60、70、80 min，研究多酚提取量的變化趨勢。

1.2.4.2 提取溫度對多酚提取效果的影響 準確稱取5份1.0 g紅毛藻藻粉，分別置于100 mL的離心管中，固定乙醇體積分數65%，料液比1:20 g/mL，提取時間1 h，設定提取溫度60、65、70、75、80 ℃，研究多酚提取量的變化趨勢。

1.2.4.3 料液比對多酚提取效果的影響 準確稱取5份1.0 g紅毛藻藻粉，分別置于100 mL的離心管中，固定乙醇體積分數65%，提取溫度70 ℃，提取時間1 h，設定料液比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50（g/mL），研究多酚提取量的變化趨勢。

1.2.4.4 乙醇體積分數對多酚提取效果的影響 準確稱取5份1.0 g紅毛藻藻粉，分別置于100 mL的離心管中，固定提取溫度70 ℃，料液比1:20 g/mL，提取時間1 h，設定乙醇體積分數50%、55%、60%、65%、70%，研究多酚提取量的變化趨勢。

1.2.5 正交試驗設計 以單因素實驗結果，運用L9（34）正交試驗（表1），研究提取時間、提取溫度、料液比和乙醇體積分數對紅毛藻多酚提取的影響，對提取工藝進行優化。

1.2.6 抗氧化試驗

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力測定 按參考文獻方法[19]適當修改，現配制0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，及不同濃度的多酚樣品溶液，在試管中先加入2 mL DPPH乙醇溶液再加入1.5 mL的多酚樣品溶液，混勻后置于37 ℃，暗條件下反應30 min，結束后測定517 nm 處吸收值，以VC作對照，計算DPPH自由基的清除率。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

式中: A0：1.5 mL蒸餾水+2 mL DPPH乙醇溶液的吸光值；A1：1.5 mL樣品溶液或VC+2 mL DPPH乙醇溶液的吸光值；A2：1.5 mL樣品溶液或VC+2 mL無水乙醇的吸光值。

1.2.6.2 ABTS自由基清除能力測定 參考文獻方法[20]，將7 mmol/L ABTS與2.45 mmol/L過硫酸鉀等比例混合靜置過夜12 h，配得ABTS母液，無水乙醇將母液稀釋至其在 734 nm處吸光度穩定在0.70±0.02。取不同濃度的多酚樣品溶液0.1 mL加入ABTS稀釋液1 mL，混勻并于室溫反應6 min，測定734 nm處的吸光度，以VC為對照，計算ABTS自由基清除率。

其中，A0：0.1 mL 蒸餾水 + 1 mL ABTS溶液的吸光值；A1：0.1 mL樣品溶液或VC+ 1 mL ABTS溶液的吸光值；A2：0.1 mL樣品溶液或VC+ 1 mL無水乙醇吸光值。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

圖1 提取時間對紅毛藻多酚提取量的影響Fig.1 Effect of extraction time fraction on polyphenol extraction of Bangia fusco-purpurea

2.1.1 提取時間對紅毛藻多酚提取量的影響 由圖1可知，提取初始時，增加提取時間使得紅毛藻多酚提取量不斷增加，在60 min時達到最高，但繼續增加提取時間，多酚的提取率反而降低。這可能是由于浸提60 min時，多酚溶出已達到平衡，隨提取時間增加，溶液中溶出的紅毛藻多酚逐漸被氧化損耗，使多酚物質被分解致使變性，結構遭到破壞，導致紅毛藻多酚的提取量下降[21]，此外長時間的提取會造成資源浪費。因此，選擇60 min作為紅毛藻多酚的最佳提取時間。

2.1.2 提取溫度對紅毛藻多酚提取量的影響 由圖2可知，紅毛藻多酚提取量隨著提取溫度的升高呈直線升高而后下降，當提取溫度70 ℃時，多酚提取量達到最高，為8.60 mg/g。當溫度增加至80 ℃時，多酚提取量降低。這可能是由于溫度的升高加快了分子運動，增加酚類物質溶出，從而提高了紅毛藻多酚的提取量。但溫度過高可能使得多酚的分子結構發生變化，另外高溫加速了紅毛藻多酚的氧化及降解，導致紅毛藻多酚提取量降低[22]。因此，選擇溫度70 ℃作為紅毛藻多酚的最佳提取溫度。

圖2 提取溫度對紅毛藻多酚提取的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on polyphenol extraction of Bangia fusco-purpurea

2.1.3 料液比對紅毛藻多酚提取量的影響 由圖3可知，在料液比 1:10 g/mL溶液過于黏稠，提取不充分，隨著料液比的增加，溶液黏度下降，使細胞內外多酚有較高的濃度差，促進使紅毛藻中酚類物質向提取液中擴散[23]，在料液比增大到1:20 g/mL時，多酚提取量達到最大，為8.35 mg/g。但當繼續提高溶劑的體積，多酚的提取量隨之下降，是因為當提取劑達到一定量時，多酚已基本浸出，而此時有多糖、色素等其他物質溶出，出現反滲透現象，導致多酚提取量下降。因此，選擇1:20 g/mL作為紅毛藻多酚提取的最佳料液比。

圖3 料液比對紅毛藻多酚提取的影響Fig.3 Effect of material to liquid ratio on polyphenol extraction of Bangia fusco-purpurea

2.1.4 乙醇體積分數對紅毛藻多酚提取量的影響 由圖4可知，當乙醇濃度在50%～60%時，紅毛藻多酚提取量隨著體積分數增加而增長，乙醇體積分數達到60%時，多酚的提取量達到最大。而后，隨乙醇濃度的提高，多酚提取量呈下降趨勢。這情況可能是由于乙醇濃度過高，多酚與溶劑極性相差較大，蛋白質變性，導致多酚溶解度降低，同時醇溶性雜質、色素成分的溶出也會影響提取效果[24-25]。因此，選擇體積分數為60%的乙醇作為最佳提取溶劑。

圖4 乙醇體積分數對紅毛藻多酚提取的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on polyphenol extraction of Bangia fusco-purpurea

2.2 正交試驗結果

運用正交試驗優化溶劑浸提法提取紅毛藻中總多酚，平行測定三次，得出工藝優化結果見表2。優化得到紅毛藻多酚的最佳提取工藝：A3B2C1D2，即提取時間70 min、提取溫度70 ℃、料液比1:10 g/mL、乙醇體積分數60%。由極差結果可知，影響提取效果的主次順序為：C（料液比）＞A（提取時間）＞B（提取溫度）＞D（乙醇體積分數）。采用SPSS進行方差分析，進一步研究各因素對紅毛藻總酚提取效果的影響結果見表3。由此得知，料液比、提取時間、提取溫度、乙醇體積分數均極顯著影響紅毛藻多酚提取效果（P＜0.01）。在最佳條件下提取紅毛藻多酚對其進行平行驗證試驗，得到多酚提取量為（9.67±0.14）mg/g。此方法提取的紅毛藻多酚提取量高于昆布（1.79 mg/g）[26]和龍須菜（1.62 mg GAE/g）[27]，說明此方法提取紅毛藻多酚是可行的。

表3 方差分析結果Table 3 The variance analysis results

2.3 抗氧化結果

2.3.1 紅毛藻多酚對DPPH自由基清除能力 DPPH醇溶液呈紫色，在517 nm處有最大吸收，海藻多酚可捕捉DPPH自由基的單電子，使其顏色變淺，從而降低吸收值，因而根據吸收值的變化，判斷多酚抗氧化效果[28]。由圖5可知，紅毛藻多酚自由基清除率隨質量濃度增加而增大，其濃度從0.2 mg/mL增加至1.6 mg/mL時，多酚對DPPH自由基的清除率從36.7%上升至93.1%。VC的清除率在高濃度時一直保持在96.9%。由試驗結果得到紅毛藻多酚IC50為0.313 mg/mL，多酚在較低濃度時對DPPH自由基的清除能力低于VC，但增加多酚濃度其抑制效果逐漸接近VC，增幅較為明顯。紅毛藻多酚的抗氧化結果可能與紅毛藻原料的處理方式有關，日曬、烘干使得多酚由于高溫或空氣氧化原因被降解，抗氧化活性降低[29]。研究認為某種物質清除自由基的IC50小于10 mg/mL，表明其具有一定的抗氧化作用[30]，由此可見紅毛藻多酚仍表現出較好的清除DPPH自由基效果。

圖5 紅毛藻多酚對DPPH·的清除效果Fig.5 DPPH·radical-scavenging activities of polyphenols of Bangia fusco-purpurea

2.3.2 紅毛藻多酚對ABTS自由基清除能力 ABTS被氧化后得到穩定的藍綠色ABTS+·，當反應體系中存在抗氧化活性成分時，ABTS自由基與其反應被清除，使得溶液顏色變淺，從而在734 nm處的吸光度降低。研究表明，吸光度越低，多酚的抗氧化能力越強，顏色越淺[31]。由圖6可知，低濃度時多酚的清除自由基能力始終低于VC，但隨著多酚濃度的增加，清除率不斷提高，并顯示濃度依賴性。紅毛藻多酚濃度在0.445 mg/mL時抑制率達到50%。而當多酚濃度在1.4 mg/mL時，自由基清除率達到96.6%，與同濃度的VC清除效果相差較小，表明紅毛藻多酚具有較好的清除ABTS自由基的能力。

圖6 紅毛藻多酚對ABTS+·的清除效果Fig.6 ABTS+· radical-scavenging capacity of polyphenols of Bangia fusco-purpurea

3 結論

采用單因素實驗和正交試驗對紅毛藻多酚的提取工藝進行優化，最佳提取工藝組合為：提取時間70 min、提取溫度70 ℃、料液比1:10 g/mL、乙醇體積分數60%，得到多酚提取量為（9.67±0.14）mg/g。此乙醇溶液浸提紅毛藻多酚的提取方法具有低毒性和操作簡單的優勢，具有可行性。由抗氧化試驗結果表明，紅毛藻多酚具有良好的抗氧化能力，其清除DPPH自由基、ABTS自由基的IC50值分別為0.313、0.445 mg/mL。紅毛藻多酚清除自由基能力與多酚濃度呈正相關，且其抗氧化效果均高于銅藻、泡葉藻、樹皮藻[32]，呈現較突出的抗氧化作用。紅毛藻中含有較為豐富的多酚，具有較強的抗氧化活性，可發展成為天然抗氧化劑或食品添加劑，從而提高紅毛藻多酚的綜合利用價值。本研究為進一步深入開展對紅毛藻多酚提取、活性的研究提供基礎參考，為拓展紅毛藻深加工產品領域提供思路。