復合酶解法制備山楂絞股藍乳清多肽復合飲料的工藝優化

蔣 瑩，沈荷玉，周可強，李 誠，姜榮杰，唐婉婷，李辰鳳

（四川農業大學食品學院，四川雅安 625014）

乳清作為生產奶酪和干酪素過程中的一種液體副產物，年產量十分高，世界乳清年產量超過180000000噸，但我國對乳清的開發和利用才剛剛起步。因此，如何合理開發利用乳清資源已成為亟待解決的問題[1-2]。近年來，西方國家關于乳清再生產方面的研究報道較多，主要是將乳清加工成乳清濃縮物、乳清粉、乳清膏等，可食用也可作飼料用，乳清再生產已成為一個蓬勃發展的行業[3-5]。乳清的組成成分中含有多種營養物質，如乳糖、乳鐵蛋白、脂肪、維生素和礦物質、生長因子等[6-7]。乳清中約含有0.6%乳清蛋白，是高質量的蛋白，但這部分乳清蛋白還沒有被大量地開發利用[8-11]。因此，如何使這些乳清蛋白得到充分利用，讓乳清增值，成為國內乳制品行業中的重大挑戰[12]。

乳清蛋白被相應酶水解后，得到生物活性肽，其中某些活性肽能夠明顯降低機體血液中的膽固醇含量[13-14]。有調查表明，未來中國成人血脂異?；疾÷屎颓嗌倌旮吣懝檀佳Y患病率將持續升高[15-16]，而現有的人工合成降膽固醇藥物不僅價格昂貴，還會帶來副作用，所以天然的降膽固醇活性因子具有巨大的開發潛力[17]。乳清是釀酒和制造飲料的理想原料，故開發研制乳清飲料是乳清利用的一個重要方向，利用乳清生產飲料，既可以充分利用乳清資源，又具有比其他利用方式（比如乳清粉、濃縮物等）工藝簡單、操作方便、產量大、經濟收益高等特點[18]。但利用乳清直接調配飲料時，熱處理往往導致乳清蛋白的變性沉淀，影響產品的感官特性，如果棄去沉淀，會損失許多的營養成分，使營養價值大大降低[19]。酶水解是改善乳清蛋白質溶解性的有效方法，且乳清蛋白水解后，降解為多肽，促進機體的消化吸收，增強蛋白質分子的表面活性，生產出的飲料產品營養健康、口感獨特[20]。

山楂制成飲料，健脾開胃，且山楂中的熊果酸及金絲桃苷也具有降低膽固醇的作用[21-22]。絞股藍號稱“南方人參”，其有效成分能夠明顯降低血液中膽固醇含量和改善肝臟脂肪病變[23-24]。因此該研究選擇乳清、山楂、絞股藍等為原料制成山楂絞股藍乳清多肽復合飲料，對中性蛋白酶和胰蛋白酶復合酶酶解工藝和飲料配方進行優化，提高乳清等原料的利用率，以期為乳清的開發和探究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮牛乳 四川農業大學農場生產；山楂、絞股藍、枸杞、蜂蜜 均為市售；檸檬酸 食品級，河南萬邦實業有限公司；中性蛋白酶（50 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）

上海瑞永生物科技有限公司；水（GB/T6682規定的三級水）、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、氫氧化鈉、對硝基苯酚、乙酸鈉、無水乙酸鈉、乙酸、甲醇、乙酰丙酮、鹽酸、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、乙醇、乙酸、磷酸、硫酸鐵銨、膽固醇標準品、?；悄懰徕c、磷酸鈉、氯化鈉、油酸（均為分析純） 源葉生物有限公司。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海力辰邦西儀器科技有限公司、D-37520型高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher 公司、Phs-3C+酸度計 方舟科技、GA12038電子天平 上海越平科學儀器有限公司；Varioskan las熒光酶標儀 美國Thermo Fisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳清復合飲料制備工藝流程

圖1 復合飲料的工藝流程圖Fig.1 The process flow diagram of complex drinks

1.2.2 乳清制備 鮮牛乳76 ℃殺菌20 s，立即冷卻，轉入離心管，8000 r/min，4 ℃，離心20 min。將下層清液（脫脂乳）轉入燒杯中。使用磁力攪拌器低速攪拌，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH滴定至pH為4.6，靜置30 min，用四層紗布過濾備用。

1.2.3 復合酶兩步分段水解乳清

1.2.3.1 酶解工藝 乳清→調節溫度和pH→中性蛋白酶酶解→90 ℃水浴滅酶5 min→調節最適溫度和pH→胰蛋白酶酶解→90 ℃水浴滅酶5 min→離心→過濾→乳清水解液

操作要點：酶解過程需要保持溫度不變、同時用NaOH（HCl）溶液維持pH恒定。

中性蛋白酶和胰蛋白酶進行分步酶解，酶解總時長為4 h，單一酶酶解完成后沸水浴鈍化，冷卻。8000 r/min離心20 min，102定性濾紙過濾，所得濾液即為乳清水解液。

1.2.3.2 優化酶解條件的單因素實驗 經過預實驗得出，中性蛋白酶最適溫度為50 ℃，pH為7.0；胰蛋白酶最適溫度37 ℃，pH為7.5。在此條件下，以膽固醇膠束溶解度抑制率為指標，對乳清進行兩步分段水解。固定酶比例1:1、酶解時間比2:1，酶用量為2%、4%、6%、8%、10%，研究酶用量對膽固醇膠束溶解度抑制率的影響。固定酶用量6%、酶解時間比1:1，酶比例為1:2、1:1、2:1、3:1、4:1，研究酶比例對膽固醇膠束溶解度抑制率的影響。固定酶用量6%、酶比例2:1，分段酶解時間1:3、1:2、1:1、2:1、3:1，研究酶解時間對膽固醇膠束溶解度抑制率的影響。

1.2.3.3 優化酶解條件的正交試驗 將兩步水解過程中的酶用量、酶比例、酶解時間比三個因素分為三個合適的水平進行正交試驗，采用L9（34）設計進行正交試驗，以膽固醇膠束溶解度抑制率為指標，確定乳清蛋白酶解的最優條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 正交實驗因素與水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.4 山楂絞股藍乳清多肽復合飲料的調配 以酶解所得的乳清多肽液中膽固醇膠束溶解度抑制率最高的乳清為原料，將絞股藍、干山楂、枸杞子挑選清洗、除雜去梗、粉碎過篩（40目）；采用煎煮法，以煮沸的乳清水解液作為溶劑，水浴提取30 min；使用200目篩子進行過濾；采用蜂蜜、檸檬酸調配口味，使酸甜均勻；使用100 mL玻璃瓶灌裝。

1.2.4.1 山楂絞股藍乳清多肽復合飲料調配的單因素實驗 以山楂含量3.0%、絞股藍含量0.25%、枸杞含量1.6%、檸檬酸含量0.05%、蜂蜜含量5%為基礎調配條件，以山楂含量（2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%）、絞股藍含量（0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%）、枸杞含量（1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、1.9%）、檸檬酸含量（0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%）、蜂蜜含量（3%、4%、5%、6%、7%）為變量進行單因素實驗，考察各個因素對山楂絞股藍乳清多肽復合飲料感官品質的影響。以感官評分來確定飲料不同成分的配方含量范圍，以便后續響應面優化試驗。

1.2.4.2 山楂絞股藍乳清多肽復合飲料調配的響應面試驗設計 綜合單因素實驗結果，根據Design-Expert 8.0.6軟件設計原理，選取山楂含量、絞股藍含量、枸杞含量、檸檬酸含量、蜂蜜含量進行5因素3水平響應面設計。試驗分析方案見表2。

1.2.5 指標測定

1.2.5.1 活性多肽膽固醇膠束溶解度抑制率測定 參照蔣琛等[25]的方法并略做修改，配制0.1 mg/mL膽固醇標準使用液和模擬膽汁膠束溶液，37 ℃培養24 h，10000×g離心60 min后取上清液測定膽固醇含量。上清液中的膽固醇含量即為膽固醇膠束溶解度(mol/L)，以不加活性肽的膠束溶液為空白，活性肽對膽固醇在模擬膽汁膠束溶液中的溶解度的抑制率計算公式為：

表2 響應面試驗設計因素水平表Table 2 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.5.2 感官評價 感官評定小組成員通過篩選確定，由8位食品專業相關人員和2位非食品專業相關人員組成。感官評價細則見表3，分別從滋味、色澤、口感、氣味4個方面對山楂絞股藍乳清多肽復合飲料進行評分，總分100分。根據每個小組成員的感官評分結果計算平均值，結果保留1位小數。要求感官評定小組成員在每評價一個樣品后需溫開水漱口，并間隔3 min再評定下一個樣品，且評價過程中避免討論。

1.2.6 飲料穩定性試驗 通過破壞性試驗[26]，即分別將飲料樣品放置在4、37 ℃，以4 ℃放置的飲料作為參照標樣，每隔1 d觀察山楂絞股藍乳清多肽功能性復合飲料的組織狀態、色澤、香味、口感的變化，并進行pH測定及菌落總數的測定，以測試山楂絞股藍乳清多肽功能性復合飲料的穩定性。

1.3 數據處理

乳清蛋白酶解最佳工藝條件確定采用IBM SPSS Statistics 26 軟件進行正交分析；運用Design-Expert 8.0.6 軟件，通過響應曲面設計分析優化飲料配方。

2 結果與討論

2.1 蛋白酶解單因素實驗分析

2.1.1 蛋白酶用量對膽固醇膠束溶解度抑制率的影響

由圖2可知，酶用量小于6%時，膽固醇膠束溶解度抑制率隨著酶用量增加而增大，在酶用量為6%時達到最大值，之后膽固醇膠束溶解度抑制率下降。根據酶促動力學，反應初期，底物蛋白和酶的結合位點還沒有完全被占據，酶用量增加，降膽固醇活性肽量增加。但當酶的用量達到一定值時會發生抑制作用，而導致所生成的降膽固醇活性肽量減少，膽固醇膠束溶解度抑制率下降[27-32]。因此，確定適宜蛋白酶用量為6%。

表3 感官評價評分指標Table 3 Sensory evaluation indexes

圖2 酶用量對膽固醇膠束溶解度抑制率的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on inhibition rate of cholesterol micelle solubility

圖3 酶比例對膽固醇膠束溶解度抑制率的影響Fig.3 Effect of enzyme ratio on inhibition rate of cholesterol micelle solubility

2.1.2 蛋白酶比例對膽固醇膠束溶解度抑制率的影響由圖3可知，酶比例小于3:1時，膽固醇膠束溶解度抑制率隨著酶比例的增大而升高，酶比例達到3:1時膽固醇膠束溶解度抑制率達到最高，之后趨于下降。每一種酶有專一的酶切位點，專一性不同的兩種酶組合起來，酶比例達到3:1時達到比較好的組合效果，能更多地切斷多肽鏈，因而提高酶解效果，降膽固醇活性肽量增加，膽固醇膠束溶解度抑制率升高[33-34]。因此確定適宜酶比例為3:1。

圖4 時間比對膽固醇膠束溶解度抑制率的影響Fig.4 Effect of time ratio on inhibition rate of cholesterol micelle solubility

2.1.3 蛋白酶分段酶解時間比對膽固醇膠束溶解度抑制率的影響 由圖4可知，膽固醇膠束溶解度抑制率隨著酶比例的增大呈現先升高后下降的趨勢，在時間比為1:1時膽固醇膠束溶解度抑制率達到最高。隨著時間比的增大，抑制率呈現下降趨勢。不同酶的最佳反應時間不同，時間延長或者縮短都會影響酶解效果，導致抑制率下降。除此之外，加熱時間延長，酶可能部分失活，酶的總活力下降，導致所生成的降膽固醇活性肽量減少，且中性蛋白酶水解過程中隨著內切位點逐漸減少，外切的活力逐漸顯現，體系中的一些多肽分子被水解為氨基酸，從而導致膽固醇膠束溶解度抑制率下降[35-37]。因此確定蛋白酶分段酶解時間比為1:1。

2.2 乳清蛋白酶解最佳工藝條件確定

2.2.1 正交試驗結果及方差分析 由表4分析結果可看出，影響酶解所得乳清多肽的膽固醇膠束溶解度抑制率的因素主次關系為酶比例＞時間比＞酶用量；由表5方差分析可看出，酶用量、酶比例和時間比對膽固醇膠束溶解度抑制率具有極顯著影響（P＜0.01）。

表4 正交試驗結果Table 4 Results of orthogonal experiments

表5 酶解條件正交試驗方差分析結果Table 5 Variance analysis of orthogonal experiment for enzymolysis conditions

由正交試驗可得，最優酶解工藝水平組合為A2B2C2，即酶用量6%、酶比例（中性蛋白酶：胰蛋白酶）3:1、時間比1:1。在該條件下所測得的膽固醇膠束溶解度抑制率平均值為89.87%，且試驗過程中三次試驗所得抑制率皆大于正交試驗中所有組合的值，故試驗結果可靠。

圖5 山楂含量對感官評分的影響Fig.5 Effect of hawthorn content on sensory score

圖6 絞股藍含量對感官評分的影響Fig.6 Effect of Gynostemma pentaphyllum content on sensory score

2.3 山楂絞股藍乳清多肽復合飲料的配方優化

2.3.1 單因素實驗結果 由圖5～圖9可知，原料含量的改變影響感官評分。由圖5可以看出，山楂含量從2.0%增加到3.0%時，感官評分隨山楂含量的增加而增大，呈現明顯的上升趨勢，且酸甜滋味可口，但在山楂含量大于3.0%時，感官評分逐漸降低，這是因為過量的山楂使飲料整體口感偏酸。因此選擇山楂含量為3.0%。由圖6可以看出，絞股藍含量從0.15%增加到0.25%時，感官評分隨絞股藍含量的增加而增大，呈現明顯的上升趨勢，但在絞股藍含量大于0.25%時，感官評分逐漸降低，這是因為過量的絞股藍使飲料口感變澀。因此選擇絞股藍含量為0.25%。由圖7可以看出，枸杞含量從1.2%增加到1.6%時，感官評分隨枸杞含量的增加而增大，呈現明顯的上升趨勢，但在枸杞含量大于1.6%時，感官評分逐漸降低，這是因為枸杞影響飲料的整齊感官顏色分層，過量的枸杞會使飲料色彩偏暗紅。因此選擇枸杞含量為1.6%。由圖8可以看出，檸檬酸含量從0.03%增加到0.05%時，感官評分隨檸檬酸含量的增加而增大，呈現明顯的上升趨勢，但在檸檬酸含量大于0.05%時，飲料酸甜比偏高，感官評分逐漸降低。因此選擇檸檬酸含量為0.05%。由圖9可以看出，蜂蜜含量從3.0%增加到5.0%時，感官評分隨蜂蜜含量的增加而增大，呈現明顯的上升趨勢，但在蜂蜜含量大于5.0%時，飲料酸甜比偏低，感官評分逐漸降低。因此選擇蜂蜜含量為5.0%。綜上，適宜的原料含量分別為山楂3%、絞股藍0.25%、枸杞1.6%、檸檬酸0.05%、蜂蜜5%。

圖7 枸杞含量對感官評分的影響Fig.7 Effect of Lycium barbarum content on sensory score

圖8 檸檬酸含量對感官評分的影響Fig.8 Effect of citric acid content on sensory score

圖9 蜂蜜含量對感官評分的影響Fig.9 Effect of honey content on sensory score

2.3.2 響應面試驗結果 為確定飲料加工最優工藝參數，采用響應面軟件設計5因素3水平的響應面優化試驗，以感官評分為響應值，結果見表6。

表6 響應面試驗設計及結果Table 6 Design and results of response surface experiment

2.3.3 響應面分析及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件對表6中的試驗結果進行多元回歸擬合分析，得出感官評分（Y）對山楂含量（A）、枸杞含量（B）、絞股藍含量（C）、檸檬酸含量（D）、蜂蜜含量（E）的回歸模型，回歸方程為：

由表7可得A、B、E、AC、A2、B2、C2、D2、E2對感官評價的影響極顯著（P＜0.01），AD對感官評價的影響顯著（P＜0.05）。其中，失擬項=0.6874＞0.05即失擬項差異不顯著，表明該回歸模型能夠較顯著擬合山楂、枸杞、蜂蜜含量對感官評分的影響，該模型能夠代替試驗真實點對試驗結果進行分析。

表7 響應面試驗ANOVA分析結果Table 7 Anova analysis of response surface experiment

2.3.4 最優配方方案的預測及驗證 運用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數據進行優化預測，即對回歸方程取一階偏導數等于0，得到感官評分最高的最佳配方參數：山楂含量2.8%、枸杞含量1.56%、絞股藍含量0.24%、檸檬酸含量0.05%、蜂蜜含量5.11%，在此條件下感官評分為88.6139。在此條件下對模型的預測參數進行3次平行驗證試驗，得到感官評分為89.60，與模型預測值接近，表明采用響應面分析法優化得到的該飲料的配方是可靠的。

2.4 飲料穩定性試驗結果

由表8試驗結果可知，以4 ℃放置的飲料作為參照標樣；山楂絞股藍乳清多肽復合飲料在37 ℃環境下放置5 d后，飲料色澤黃色變深，開蓋有明顯異味，菌落總數急劇增加，pH下降。再存放1 d后腐敗更嚴重，無法飲用故停止試驗。由此推算山楂絞股藍乳清多肽復合飲料在4 ℃保質期約為5個月，室溫環境下放置下50 d后出現色澤仍然正常。

表8 飲料穩定性試驗結果Table 8 Test results of beverage stability

2.5 提高山楂絞股藍乳清多肽復合飲料穩定性的操作要點

a. pH對蛋白質飲料的穩定性有十分顯著的影響。飲料的pH愈接近蛋白質的等電點，蛋白質愈容易絮凝析出。因此，在配料時必須用檸檬酸將飲料的pH調整為＜4.5或＞6.8，否則將不可避免地產生絮凝沉淀現象，而本飲料的pH為4.3。

b. 分散質粒度較大，對飲料穩定性的影響至關重要。若粒度較大，便容易在其重力作用下沉淀析出。因此，蛋白質飲料一般采取均質機對蛋白飲料粒子進行細微化處理，以提高飲料的穩定性，而本飲料在20 MPa和60 ℃條件下進行均質。

c.殺菌條件不嚴格，無論哪個生產環節沒有做好嚴格的殺菌工作，都可能導致飲料的劣變：如pH下降，分層沉淀，腐敗變質等。本飲料在121 ℃條件下進行兩次滅菌操作，時長分別為5和1 min。

d.飲料保存過程中需低溫冷藏（0～4 ℃），否則會分層沉淀。

3 結論

兩步水解酶解乳清蛋白制取乳清蛋白肽的最佳工藝是采用中性蛋白酶和胰蛋白酶，酶添加總量6%，酶比例3:1，酶解總時間4 h，分段酶解時間比1:1，在此條件下膽固醇抑制率值為89.87%。且正交試驗分析得到影響酶解所得乳清多肽的膽固醇膠束溶解度抑制率的因素主次關系為酶比例＞時間比＞酶用量。以酶解所得的乳清多肽液中膽固醇膠束溶解度抑制率最高的乳清為原料，制備山楂絞股藍乳清多肽復合飲料，經過響應面分析數據優化配方，得到該飲料感官評分最高（89.60）的最佳配方參數為：山楂含量2.8%、枸杞含量1.56%、絞股藍含量0.24%、檸檬酸含量0.05%、蜂蜜含量5.11%。

圖10 兩因素交互作用響應面圖Fig.10 Response surface diagram interaction between two factors