響應面法優(yōu)化黑胡蘿卜紅色素雙水相萃取工藝

李治城，武玉倩，張婕妤，展亞莉，常秀蓮,

（1.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264005；2.青島鵬遠康華天然產(chǎn)物有限公司，山東萊西 266612）

黑胡蘿卜（Daucus carotaL.），十字花科蘿卜屬，起源于土耳其、埃及和遠東國家[1]，近些年來在我國開始種植，但由于種植面積較小，產(chǎn)量較低，并未在市面上廣泛流通。黑胡蘿卜根部呈紫黑色，其中的花青素是自然界中廣泛存在于植物中的天然水溶性色素，也是植物當中主要的呈色物質(zhì)之一[2]，同時也具有多種生理活性，例如清除自由基、抗氧化、抗癌等[3-5]。黑胡蘿卜花青素作為一種新型的天然水溶性植物色素，因其含有酰化的基團，在弱酸性和中性條件下能夠表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性[6]。隨著消費者對食品安全的關注度不斷提高，天然植物提取的色素更易受到人們的青睞，因此，將黑胡蘿卜紅色素作為傳統(tǒng)合成色素的替代品添加到食品當中具有十分廣闊的市場前景[7-8]。

目前花青素的提取方法主要有溶劑提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取等[9-10]方式，但存在提取液雜質(zhì)過多、耗能較大，無法實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的問題。大孔吸附樹脂廣泛應用于花青素的分離、純化[11-12]，可以實現(xiàn)色素與其糖類物質(zhì)的分離，但生產(chǎn)周期較長,色素的穩(wěn)定性差，容易導致色素產(chǎn)品的損失。雙水相萃取作為一種新型、快速、低成本的操作方式，能夠較好地保留目標產(chǎn)物的生物活性，且選擇性強，易于工業(yè)放大[13-14]，廣泛應用于花青素的提取分離[15-16]。翟碩等[17]通過比較研究得出采用雙水相萃取的方法提取黑豆皮花青素的效果最好，得率最高為2.81 mg/g；Liu等[18]利用響應面法優(yōu)化雙水相體系對紫甘薯花青素進行萃取，在最佳條件下花青素的得率可以達到90.02%。

本文以黑胡蘿卜作為研究對象，使用PEG6000/硫酸銨雙水相體系來實現(xiàn)黑胡蘿卜紅色素與糖類物質(zhì)分離。根據(jù)先前的研究[19-20]優(yōu)化對雙水相萃取效果影響較大的三個因素（硫酸銨、PEG6000和粗提液的質(zhì)量分數(shù)），并通過響應面分析法優(yōu)化萃取工藝，為工業(yè)上快速提取黑胡蘿卜紅色素提供了參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

黑胡蘿卜 青島鵬遠康華天然產(chǎn)物有限公司；D-無水葡萄糖、硫酸銨（分析純） 天津市致遠化學試劑有限公司；硫酸、L（+）-抗壞血酸（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；苯酚（優(yōu)級純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；PEG6000（分析純） 無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；鹽酸（分析純） 萊陽經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)精細化工廠；DPPH（1.1-二苯基-2-苦肼基自由基）（分析純） 如吉生物科技。

pH211酸度計 意大利哈納公司；JYZ-V5PLUS榨汁機 杭州九陽小家電有限公司；GT10-2高速臺式離心機 北京時代北利離心機有限公司；XW-80A漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；752S紫外可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；AR1530分析天平 奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑胡蘿卜色素粗提液制備 取1000.0 g黑胡蘿卜洗凈、切碎，使用榨汁機榨取原汁，260目濾布過濾，3000 r/min離心30 min，取上層色素溶液使用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.0，于2～4 ℃冷藏保存。

1.2.2 構建雙水相體系 固定體系質(zhì)量為30.0 g，在50 mL離心管中分別加入一定質(zhì)量的硫酸銨和400 g/L的PEG6000原液，加入一定質(zhì)量的pH為3.0的色素粗提液，加入去離子水補至體系質(zhì)量為30.0 g，置于漩渦混合器上于室溫下混合25 min后取下，置于離心機中，4000 r/min離心10 min后取出，靜置至上下相體積不再發(fā)生變化。

1.2.3 單因素實驗設計 分別考察硫酸銨、PEG6000和色素粗提液的質(zhì)量分數(shù)對選擇性系數(shù)和萃取率的影響，具體方法如下：

固定體系質(zhì)量為30.0 g，在離心管中加入質(zhì)量分數(shù)為18.0%的PEG6000原液，加入質(zhì)量分數(shù)為18.0%的色素粗提液，分別加入質(zhì)量分數(shù)為16.0%、18.0%、20.0%、22.0%、24.0%的硫酸銨，剩余的質(zhì)量由去離子水補充，考察不同質(zhì)量分數(shù)的硫酸銨對選擇性系數(shù)β和萃取率Y的影響。

固定硫酸銨的質(zhì)量分數(shù)為上述實驗優(yōu)化值，其它條件不變，分別加入質(zhì)量分為10.0%、12.0%、14.0%、16.0%、18.0%的PEG6000原液，考察不同質(zhì)量分數(shù)的PEG6000對選擇性系數(shù)β和萃取率Y的影響。

固定硫酸銨、PEG6000的質(zhì)量分數(shù)為上述實驗優(yōu)化值，其它條件不變，分別加入質(zhì)量分數(shù)為8.0%、10.0%、12.0%、14.0%、16.0%的色素粗提液，考察不同色素粗提液的質(zhì)量分數(shù)對選擇性系數(shù)β和萃取率Y的影響。

1.2.4 響應面分析法優(yōu)化試驗設計 在單因素實驗的基礎上，選取誤差相對較小的萃取率Y為響應值，選擇硫酸銨、PEG6000以及粗提液的質(zhì)量分數(shù)為實驗因素組成三因素三水平Box-Behnken試驗，響應面試驗設計如表1所示。

表1 響應面試驗設計Table 1 Design of response surface experiment

1.2.5 黑胡蘿卜紅色素抗氧化性評價 以VC作為陽性對照，分別對萃取前后的黑胡蘿卜紅色素進行DPPH自由基清除能力實驗[21-22]。取1.0 mL不同濃度的樣品溶液，加入0.4 mmol/L DPPH乙醇溶液0.50 mL，加水2.0 mL，混勻后暗處反應30 min，于517 nm處測定其吸光度值。根據(jù)公式（1）計算DPPH自由基的清除率。

式中：A0：空白對照的吸光度值；A1：加入樣品反應后的吸光度值；A2：樣品自身干擾的吸光度值。

1.2.6 總花色苷含量及總糖含量測定 黑胡蘿卜紅色素屬于花色苷類化合物，采用示差法按公式（2）對其含量進行測定[23]，以矢車菊-3-葡萄糖苷計。

式中：吸光度A = (A520- A700)pH1.0- (A520-A700)pH4.5；M：矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量，449.2 g/mol；D：樣品儲備液的稀釋倍數(shù)；1：光路長，cm，測試中采用1 cm光路長的比色皿；ε：26900，矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，L·mol-1·cm-1；1000：由g換算成mg的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

采用苯酚-硫酸法對上下相中總糖含量進行測定[24]。分別精密吸取上下相樣品稀釋液1.0 mL于試管中，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，迅速加入濃硫酸溶液5.0 mL，搖勻，放置10 min后于40.0 ℃水浴加熱10 min[25]，取出后冷卻至室溫，以相應試劑為空白，在490 nm處測定吸光度，得到回歸方程為：y=8.5971x+0.0165，R2=0.9989，表明在0.00～0.10 mg/mL范圍內(nèi)，葡萄糖濃度與其吸光度呈現(xiàn)良好的線性關系。

1.2.7 選擇性系數(shù)β及萃取率Y的計算 用注射器分別移取上下相溶液于試管中，讀取上下相溶液體積，并根據(jù)示差法和苯酚硫酸法分別對上下相中花青素的含量和總糖含量進行測定，根據(jù)公式（3）、（4）和（5）分別計算相比R、選擇性系數(shù)β和萃取率Y[26]。

式中：Vt、Vb：分別為上、下相的體積，mL；K花、K糖：分別為花青素、糖類物質(zhì)的分配系數(shù)；C上花、C下花：分別為上相、下相中花青素的濃度，mg/L；C上糖、C下糖：分別為上相、下相中糖類物質(zhì)的濃度，mg/mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert V 8.0.6.1和Origin Pro 8.0進行響應面實驗設計及數(shù)據(jù)處理，所有試驗均重復3次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 硫酸銨的質(zhì)量分數(shù)對選擇性系數(shù)和萃取率的影響 由圖1可知，隨著硫酸銨質(zhì)量分數(shù)的增加，選擇性系數(shù)β和萃取率Y先升高后降低，但選擇性系數(shù)升高較快而后緩慢下降，萃取率升高較緩后快速下降。在硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為20.0%時兩者達到最高值，分別為283.57和90.3%。這可能因為隨著硫酸銨質(zhì)量分數(shù)的增加，下相水合能力逐漸增強，加強了上下兩相物質(zhì)的分離效果，提高了上相中花青素的濃度[27]，但硫酸銨的過量加入會存在于上相中，不利于色素的萃取[28]。因此，硫酸銨的質(zhì)量分數(shù)選擇為20%。

圖1 硫酸銨的質(zhì)量分數(shù)對選擇性系數(shù)和萃取率的影響Fig.1 Effect of mass fraction of ammonium sulfate on selectivity coefficient and extraction rate

圖2 PEG6000的質(zhì)量分數(shù)對選擇性系數(shù)和萃取率的影響Fig.2 Effect of mass fraction of PEG6000 on selectivity coefficient and extraction rate

2.1.2 PEG6000的質(zhì)量分數(shù)對選擇性系數(shù)和萃取率的影響 由圖2可知，隨著PEG6000質(zhì)量分數(shù)的增加，選擇性系數(shù)β和萃取率Y大體呈現(xiàn)出相同的上升和下降的趨勢，并在PEG6000質(zhì)量分數(shù)為14.0%時兩者達到最高值，分別為318.28和91.2%。在黑胡蘿卜粗提液質(zhì)量一定的情況下，PEG6000質(zhì)量分數(shù)的提高可以增加對黑胡蘿卜花青素的萃取效果。但隨著PEG6000的繼續(xù)加入使得整個體系黏度增加傳質(zhì)受阻[29]，不利于花青素在上相中的分配，使β值出現(xiàn)下降趨勢。因此，PEG6000的質(zhì)量分數(shù)選擇為14%。

2.1.3 粗提液質(zhì)量分數(shù)對選擇性系數(shù)和萃取率的影響圖3可知，在粗提液質(zhì)量分數(shù)在8.0%～12.0%范圍內(nèi)，隨著粗提液質(zhì)量分數(shù)的增高，選擇性系數(shù)β也逐漸增加，而萃取率Y趨于平緩，在粗提液質(zhì)量分數(shù)為12.0%時選擇性系數(shù)和萃取率分別達到最大值269.01和90.8%。隨著粗提液質(zhì)量分數(shù)的繼續(xù)增高，上相PEG對花青素的萃取能力趨近飽和，下相當中花青素的含量開始上升，選擇性系數(shù)和萃取率均呈現(xiàn)出下降趨勢。因此，粗提液的質(zhì)量分數(shù)選擇為12%。

圖3 粗提液質(zhì)量分數(shù)對選擇性系數(shù)和萃取率的影響Fig.3 Effect of mass fraction of crude extract on selectivity coefficient and extraction rate

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗方案及結果分析 Box-Behnken響應面法對雙水相萃取黑胡蘿卜紅色素中的硫酸銨質(zhì)量分數(shù)、PEG6000質(zhì)量分數(shù)以及粗提液的質(zhì)量分數(shù)優(yōu)化的結果如表2所示。

表2 響應面試驗結果Table 2 Results of response surface experiment

采用Design-Expert V8.0對黑胡蘿卜紅色素的萃取得率Y進行數(shù)據(jù)分析得到各因素的回歸擬合方程如下：

為證明此方程的有效性，對上述模型進行方差分析，結果如表3所示。由表3可知，模型中的A2和C2對黑胡蘿卜紅色素萃取率的影響極顯著（P＜0.01），A和B2對黑胡蘿卜紅色素萃取率的影響顯著（P＜0.05），而硫酸銨質(zhì)量分數(shù)、PEG6000的質(zhì)量分數(shù)以及粗提液的質(zhì)量分數(shù)之間的兩兩交互作用的影響并不顯著（P＞0.05）。回歸模型屬于極顯著水平（P=0.0009＜0.01）；失擬項差異不顯著（P= 0.9371＞0.05）；模型決定系數(shù)R2為0.9496，證明所選的二次回歸模型是合理的，且所選模型的擬合程度較好，可以對雙水相萃取黑胡蘿卜紅色素的結果進行分析和預測。根據(jù)回歸方程和方差分析可知，各因素對黑胡蘿卜紅色素萃取率的影響程度由大到小依次為A＞C＞B，即硫酸銨質(zhì)量分數(shù)＞粗提液質(zhì)量分數(shù)＞PEG6000質(zhì)量分數(shù)。

表3 響應面試驗方差分析結果Table 3 Results of analysis of variance of response surface experiment

硫酸銨、PEG6000、粗提液質(zhì)量分數(shù)之間相互作用的響應面曲線如圖4所示。由圖（a）和圖（b）可以看出，響應面呈現(xiàn)一定程度的凸起，響應面圖中硫酸銨質(zhì)量分數(shù)曲線較陡，說明A（硫酸銨質(zhì)量分數(shù)）對萃取率Y的影響較大；A（硫酸銨質(zhì)量分數(shù)）和B（PEG6000質(zhì)量分數(shù)），B（PEG6000質(zhì)量分數(shù)）和C（粗提液質(zhì)量分數(shù)）的交互作用不顯著；由圖（c）可以看出B（PEG6000質(zhì)量分數(shù)）和C（粗提液質(zhì)量分數(shù)）之間的交互作用不顯著，但從曲線的陡峭程度可以看出，粗提液質(zhì)量分數(shù)對萃取率的影響程度要高于PEG6000質(zhì)量分數(shù)。

2.2.2 最佳工藝條件的預測及驗證實驗 根據(jù)響應面模型預測雙水相萃取黑胡蘿卜紅色素的實驗條件為：硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為20.21%、PEG6000質(zhì)量分數(shù)為13.89%、粗提液質(zhì)量分數(shù)為11.83%，理論黑胡蘿卜紅色素萃取率為94.38%。根據(jù)實驗實際操作，將最佳工藝條件調(diào)整為：硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為20.0%、PEG6000質(zhì)量分數(shù)為14.0%、粗提液質(zhì)量分數(shù)為12.0%，在此工藝條件下進行驗證實驗，做重復試驗3次，黑胡蘿卜紅色素的平均萃取率為94.17%，與模型預測值基本符合，表明所選模型合理，能夠模擬和預測該雙水相體系對黑胡蘿卜紅色素的萃取效果。

圖4 各因素相互作用響應面圖Fig.4 Response surface plot of the interaction between various factors

2.3 黑胡蘿卜紅色素抗氧化性評價DPPH自由基清除能力實驗

由圖5可知，隨著樣品質(zhì)量濃度的提高，萃取前后的黑胡蘿卜紅色素對DPPH自由基的清除能力也逐漸提升，且VC在質(zhì)量濃度達到20.0 mg/L后出現(xiàn)平臺期，對DPPH自由基的清除率均在95%以上。IC50值可以用來反映樣品的抗氧化性，且數(shù)值越小，樣品抗氧化的能力越強[30]。經(jīng)計算，VC和萃取前、后黑胡蘿卜紅色素的IC50值分別為8.09、26.32、30.51 mg/L，可以看出萃取前、后的黑胡蘿卜紅色素均具有較好的抗氧化性，但都弱于VC。萃取后仍然保留了黑胡蘿卜紅色素的抗氧化能力，但有所下降，這可能是雙水相萃取將糖類物質(zhì)萃取到下相造成的。

圖5 黑胡蘿卜紅色素和VC的DPPH自由基清除能力Fig.5 DPPH free radical scavenging ability of black carrot red color and VC

3 結論

研究了PEG6000/硫酸銨雙水相體系萃取黑胡蘿卜紅色素的工藝條件，最佳工藝條件如下：硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為20.0%，PEG6000質(zhì)量分數(shù)為14.0%，粗提液質(zhì)量分數(shù)12.0%，黑胡蘿卜花青素的平均萃取率為94.17%。對采用本方法得到的黑胡蘿卜紅色素進行抗氧化性實驗，計算得到IC50值為30.51 mg/L，仍保留了其較好的清除DPPH自由基的效果。本研究為黑胡蘿卜紅色素的提取方法提供了參考，能夠?qū)崿F(xiàn)黑胡蘿卜紅色素與其糖類物質(zhì)的有效分離，但對于實現(xiàn)企業(yè)生產(chǎn)而言，如何實現(xiàn)聚合物與花青素的分離，仍然需要進一步的研究。