QuEChERS試劑盒-高效液相色譜法檢測雞蛋中阿散酸和洛克沙砷殘留

趙 穎，李典典，張大衛，魏 月，馬晶軍

（河北農業大學理工學院，河北滄州 061100）

阿 散 酸（arsanilic acid，ASA）和 洛 克 沙 砷（roxarsone，ROX）等有機砷制劑被廣泛應用于畜禽生產中，其添加目的為促進生物生長，并提高飼料的利用率[1-2]。由于動物長期食用添加ASA和ROX的飼料，導致生物體內器官及組織中會殘留有機砷類物質，并通過食物鏈的作用對人體生理機能造成不同程度的破壞[3-5]。我國于2017年7月31日發布停止使用ASA和ROX作為飼料添加劑的公告，但目前對二者的研究主要集中在飼料、肉類食品中，例如SaucedoVelez等[6]利用微波輔助萃取技術聯合高效液相色譜法對牲畜飼料中ASA、ROX及硝苯砷酸進行痕量測定；王瑩等[7]采用高效液相色譜串聯質譜技術分析雞肉中ROX殘留量及其代謝物殘留規律，而對蛋類的研究則較少，因此有必要建立定量檢測雞蛋中的ASA和ROX的方法，為完善動物源性食品中有害物質的分析標準提供技術支持。

近些年，常用于食品中有機砷制劑的萃取方法有固相萃取法（solid phase extraction，SPE）[8-9]、超聲波輔助萃取法[10-11]、加速溶劑萃取法[12-14]等，然而這些萃取方法或操作繁瑣或耗時較長，不適用于檢測大批量的樣品。2003年，Anastassiades等[15]首次建立了 QuEChERS（Quick, Easy, Cheap, Effective,Rugged, Safe）前處理方法用于果蔬中農藥殘留的檢測，該方法簡便、高效、安全，耗時較短且減少了有機溶劑使用量，近幾年被廣泛應用于動物源性食品中獸藥的殘留分析[16]。

本試驗擬采用QuEChERS的前處理方法，聯合高效液相色譜技術（high performance liquid chromatography，HPLC）定量分析雞蛋中痕量的ASA和ROX，以期為動物源性食品中有機砷類獸藥殘留提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈、三氟乙酸 均為色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司；ASA、ROX 純度≥99%，上海楚定分析儀器有限公司；多壁碳納米管 純度≥97%，中國科學院成都有機化學有限公司；QuEChERS分散固相萃取凈化試劑盒（型號：5982-5022，內含凈化填料400 mg PSA、400 mg C18EC、45 mg GCB、1199 mg MgSO4） 美國Agilent公司；QuEChERS萃取試劑盒（型號：5982-5058，配有袋裝萃取填料MgSO4、NaCl） 美國Agilent公司；DIKMA ProElut C18填料 北京迪科馬科技有限公司；弗羅里硅土、氧化鋁填料 北京邁瑞達科技有限公司；Waters Oasis MAX固相萃取柱（規格：3cc/60 mg） 上海楚定分析儀器有限公司。

1525型高效液相色譜儀，配有2998光電二極管陣列檢測器 美國Waters公司；ZORBAX Eclipse Plus C18液相色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×50 mm）、Agilent 6460型串聯三重四極桿質譜，配Agilent1290型液相色譜儀 美國Agilent公司；HC-3018R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；HGC-12A型氮吹儀 恒奧科技發展有限公司；MXS型渦旋儀 美國SCILOGEX公司；Mill Q超純水系統 美國Millipore公司；KQ5200E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；AUY120/220型電子天平 日本島津科技有限公司；FG-12型固相萃取儀器 天津市富城達科技有限公司；SHZ-111循環水真空泵 上海知信實驗儀器技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液制備 分別稱取2.5 mg（精確到0.1 mg）ASA、ROX標準品至25 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成100 mg/L的標準儲備液，避光保存。將標準儲備液用甲醇稀釋成1.00、5.00、10.00、50.00、100.00 mg/L的系列標準工作溶液待用。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 SPE法 取0.5 g（精確到0.1 mg）雞蛋樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇與5%三氟乙酸水溶液（9:1，V/V），渦旋5 min，10000 r/min離心5 min，將上清液轉移至10 mL離心管中，殘渣中再加入提取液5 mL，重復上述步驟，合并上清液，經旋蒸至剩余5 mL，再分別用C18柱、MAX柱和填充多壁碳納米管柱對ASA、ROX進行凈化。試驗中SPE裝置凈化步驟： 取5 mL甲醇活化0.5 g（精確到0.1 mg）固相萃取小柱；5 mL上清液進行上樣；5 mL甲醇與水（1:1，V/V）淋洗雜質；采用優化的洗脫劑甲醇與甲酸（60:40 ，V/V）5 mL進行洗脫，收集洗脫液，流速控制為1 mL/min。30 ℃用氮吹吹至1 mL以下，用甲醇定容至1 mL，過0.45 μm有機濾膜，供HPLC檢測。

1.2.2.2 基質固相分散萃取法（matrix solid phase dispersion extraction，MSPDE） 向瑪瑙研缽中準確加入0.5 g（精確到0.1 mg）加標樣品，分別用0.5 g（精確到0.1 mg）弗羅里硅土與0.5 g（精確到0.1 mg）中性氧化鋁填料進行凈化，充分研磨5 min，使樣品與填料完全混勻，并將混合物轉移至萃取柱中。用甲醇與甲酸（60:40，V/V）作洗脫劑，在重力作用下對目標物進行洗脫，隨后用10 mL離心管收集洗脫液。收集3 mL后，30 ℃氮吹吹至1 mL以下，甲醇定容至1 mL，過0.45 μm有機濾膜，進行色譜分析。

1.2.2.3 QuEChERS試劑盒法 取0.5 g（精確到0.1 mg）雞蛋勻漿于50 mLQuEChERS萃取管（配有袋裝萃取填料MgSO4、NaCl）中，加入15 mL乙腈與10%三氟乙酸的甲醇溶液（1:1，V/V），渦旋5 min，再加入QuEChERS試劑盒的提取填料，10000 r/min離心5 min，移取上層液（約5 mL）于QuEChERS凈化管（內含凈化填料400 mg PSA、400 mg C18EC、45 mg GCB、1199 mg MgSO4）中，渦旋5 min，10000 r/min離心5 min，移取上清液于氮吹管中，氮氣吹至1 mL以下，甲醇定容至1 mL，過0.45 μm有機濾膜，得待測樣品。

1.2.3 HPLC檢測條件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18液相色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×50 mm），柱溫20 ℃，進樣量：10 μL。檢測波長為260 nm。流動相為甲醇與0.1%三氟乙酸水溶液（30:70，V/V），等度洗脫。

1.2.4 UPLC-MS/MS檢測條件 色譜條件：流動相為0.1%三氟乙酸水溶液（A）與 甲醇（B），等度洗脫泵A與泵B（70:30，V/V），流速為0.2 mL/min，進樣量2 μL。質譜條件：電噴霧電離源（ESI），負離子掃描，錐孔電壓40 V，毛細管電壓3.5 kV，脫溶劑氣溫度350℃。采用多反應監測掃描模式（MRM），ASA定性離子為m/z 123.03，碰撞能量16 V，及m/z 107.16，碰撞能量為34 V；ROX定性離子為m/z 123.26，碰撞能量為25 V，及m/z 153.07，碰撞能量34 V。

1.2.5 方法學評價

1.2.5.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限 用ASA、ROX標準儲備液配制濃度分別為1.00、5.00、10.00、50.00、100.00 mg/L的標準工作溶液，進樣后制作標準曲線，方法在1.00～100.00 mg/L范圍內線性良好。將加標濃度逐級稀釋添加于樣品中測定信噪比，以3倍噪音（RSN=3）確定檢測限（LOD）、以10倍噪音（RSN=10）確定定量限（LOQ）。

1.2.5.2 回收率和精密度 以空白基質樣品進行1.00、50.00、100.00 mg/L 3個水平的加標回收試驗，重復測定6次，按建立的方法處理樣品，測定并計算回收率和精密度。

1.2.6 實際雞蛋樣品測定 選擇普通雞蛋、柴雞蛋做實際樣品測定，分別采集了4份來源不同的雞蛋樣品進行測定。試驗樣品的來源分別是：普通雞蛋1，河北省保定市農貿市場；普通雞蛋2，河北省保定市大型超市；普通雞蛋3，河北省保定市某養雞場；普通雞蛋4，河北省保定市某集市；柴雞蛋1，河北省保定市某養雞場；柴雞蛋2，河北省保定市批發市場；柴雞蛋3，河北省保定市大型超市；柴雞蛋4，河北省保定市菜市場。

1.3 數據處理

利用Microsoft Excel 2019軟件進行數據整理分析。采用Origin 2017制圖軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 優化比較前處理方法

本試驗首次比較了SPE法、MSPDE法及QuEChERS法中不同凈化填料對目標有機砷制劑的凈化效果，結果如圖1所示。黃佳佳等[17]研究了多壁碳納米管（MWCNTs）作為SPE填料對農獸藥的吸附能力，結果表明其對極性化合物凈化效果較好。故本試驗比較了C18、MAX[9]和MWCNTs填料對目標有機砷制劑的凈化效果，結果表明，C18對兩種極性化合物吸附效果差，其具有較強疏水性；MAX填料吸附效果較好，但不易將目標物洗脫下來，操作繁瑣；MWCNTs填料凈化能力明顯優于其它填料，由于其比表面積大，吸附能力較強，對于極性有機化合物有較高富集能力[18]，但在目標化合物附近易存在一定程度的色譜峰干擾，且回收率低于QuEChERS法。

在MSPDE法中，分別優化比較弗羅里硅土（Florisil）與中性氧化鋁填料[19]凈化效果，二者均為強極性吸附劑，對有機砷制劑有一定吸附能力。結果表明，添加Florisil對ASA、ROX的色譜圖響應值較高。但采用優化的Florisil凈化樣品時，洗脫液有較多雜質，柱凈化難度較大，除雜能力較弱。

QuEChERS法應用QuEChERS試劑盒進行樣品提取凈化，操作簡單，省略了SPE中淋洗、洗脫等步驟，減少了分析物在轉移過程的損失，且前處理快速；同時該法相比于MSPDE法雜質干擾小，凈化萃取柱中含有的PSA、GCB等組合填料有效去除了雞蛋樣品中蛋白、磷脂以及色素等干擾物質，顯著降低了基質效應。故本試驗選擇QuEChERS法進行前處理操作。姜濤等[20]利用微波輔助萃取法分析測定雞蛋中ASA、ROX含量，但該儀器成本較貴，且試驗所需優化影響因素較多，操作較繁瑣，本試驗中QuEChERS法裝置簡單成本較低，無需復雜操作且準確度較高。

凈化效果越好，基質對目標化合物的干擾越小。由圖1可知，3種方法對于同一加標濃度1 mg/L雞蛋樣品的凈化效果，用QuEChERS法獲得的響應值更高，并且在同一實驗條件下目標物回收率均達到80%以上。為了使目標物回收率達到最佳，需對QuEChERS法進一步優化。

圖1 三種前處理條件下不同凈化填料的比較Fig.1 Comparison of different purification fillers under three pretreatment conditions

2.2 QuEChERS法條件的優化

2.2.1 萃取劑組成及濃度的優化 常見有機砷提取劑包括純水、甲醇等單一有機溶劑或有機溶劑和水按一定比例的混合溶液。本試驗在Eom等[21]研究的基礎上，在同一提取比例下對不同萃取劑組成的乙腈、甲醇、水混合提取液進行優化試驗，乙腈與甲醇組合時提取液較澄清，但由于雞蛋樣品中蛋白質含量較高，而酸性條件下有利于蛋白質沉淀，因此選擇含三氟乙酸的甲醇溶液沉淀蛋白，并優化含三氟乙酸體積分數分別為0.05%、1%、5%、10%、15%的甲醇溶液對蛋白質沉淀和目標物萃取效率的影響（圖2）。結果表明，當采用乙腈與10%三氟乙酸的甲醇混合溶液時提取效率較好，ASA、ROX的回收率均達到91%以上。

圖2 在相同試驗條件下萃取劑濃度對回收率的影響Fig.2 Effect of extractant concentration on the recovery under the same experimental conditions

2.2.2 萃取劑比例的選擇 肖亞兵等[12]研究表明提取劑比例影響有機砷制劑的提取效率，故為保證萃取完全，試驗比較了不同比例的萃取劑，如圖3所示，乙腈與10%三氟乙酸的甲醇溶液（1:1，V/V）時，可最大程度地從雞蛋樣品中提取出ASA、ROX，且基質干擾較小。試驗還比較提取次數對萃取率的影響，發現提取次數過多時，萃取率反而下降，可能是由于有機砷類物質與基質相互作用，導致目標物有所損失，故試驗選擇了一次提取。在采用優化的萃取劑比例下，兩種目標物的回收率均達到了93%以上。

圖3 相同試驗條件下萃取劑比例對回收率的影響Fig.3 Effect of extractant in different proportions on the recovery under the same experimental conditions

2.3 HPLC條件的優化

通過二極管陣列檢測器對ASA、ROX混合標準溶液進行全波長掃描，試驗表明在260 nm處ASA、ROX有較強吸收。并采用Waters Atlantis T3 5 μm色譜柱對目標物質ASA、ROX進行分離。當只采用甲醇與水時，ASA出峰時間延后，且峰的銳度不好。楊麗君等[22]研究表明在流動相中添加一定量的三氟乙酸，有效縮短出峰時間，改善峰型。因此本實驗中優化比較了甲醇分別與體積分數為0.01%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%的三氟乙酸水溶液作為流動相時目標物的出峰情況，最終采用甲醇與0.1%三氟乙酸水溶液（30:70，V/V），在10 min內實現兩種目標物的良好分離，ASA、ROX保留時間分別為3.298、6.174 min，柱效較高，峰型尖銳對稱，基線平穩，無雜峰干擾（如圖4）。

圖4 加標雞蛋樣品的HPLC圖Fig.4 HPLC diagram of standard egg sample

2.4 UPLC-MS/MS條件的優化

為了豐富檢測ASA、ROX的儀器方法，試驗中還利用了UPLC-MS/MS對樣品進行測定。流動相中的三氟乙酸可以改善峰型，并且有助于提高質譜負離子掃描時的離子化效率，故同樣使用甲醇與0.1%三氟乙酸水溶液（30:70，V/V）作為流動相，等度洗脫，提高柱溫對分離無明顯效果，故確定現有色譜條件。

為提高分析靈敏度，選用MRM進行檢測，同時對ASA、ROX進行定性離子通道分析，使定性更為準確；兩種有機砷物質呈弱酸性且易失質子，質譜條件選擇負離子模式，并采用電噴霧離子源，明顯降低離子干擾[23]。試驗還對噴霧電壓、碰撞能量及離子源溫度等參數進行了優化，進而提高方法準確性。結果表明，在優化條件下，以3倍噪音（RSN=3）確定LOD、以10倍噪音（RSN=10）確定LOQ。ASA的LOD為0.122 μg/kg，LOQ為0.372 μg/kg；ROX的LOD為0.254 μg/kg，LOQ為0.760 μg/kg。該方法檢測限低、靈敏度高，但檢測成本昂貴，且檢測周期較長，不利于向中小型企業或檢測機構推廣。為了降低成本及考慮到方法的實用性，本試驗使用HPLC技術分析檢測兩種目標物。

2.5 方法學評價

2.5.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限 將ASA、ROX混合標準儲備液用甲醇稀釋成濃度為1.00、5.00、10.00、50.00、100.00 mg/L的系列標準液，每個濃度重復測定5次。以色譜峰面積（Y）為縱坐標，ASA、ROX濃度（X）為橫坐標繪制標準曲線。在HPLC最佳檢測條件下，ASA線性方程為y=3.59×104x+1.33×105，R=0.999831；ROX線 性 方 程 為y=2.23×104x+6.59×103，R=0.999562，在 線 性 范 圍1.00～100.00 mg/L線性關系良好。根據1.2.2樣品前處理方法，以3倍噪音（RSN=3）確定LOD、以10倍噪音（RSN=10）確定LOQ。ASA、ROX的LOD分別為0.044、0.063 mg/kg；LOQ分別為0.149、0.211 mg/kg。試驗還比較了近幾年不同分析方法的靈敏度，見表1。

表1 不同方法靈敏度的比較Table 1 Sensitivity comparison of different methods

2.5.2 回收率和精密度 以空白基質樣品進行3個水平的加標回收試驗，重復測定6次，按建立的方法處理樣品，測定并計算回收率和精密度見表2。結果如下：ASA的回收率92.32%～95.95%，相對標準偏差1.54%～4.92%；ROX回收率89.84%～94.91%，相對標準偏差2.19%～5.87%。加標雞蛋樣品的HPLC圖見圖4。

表2 樣品加標回收率及精密度Table 2 Recovery and precision of standardized samples

2.6 實際雞蛋樣品測定

檢測了普通雞蛋和柴雞蛋中ASA和ROX的含量，分別采集了4份來源不同的樣品進行分析。試驗中實際雞蛋樣品采集自私人養雞場、農貿市場、菜市場、超市、批發市場和集市上，采集地點養雞場、市場可能存在缺乏監管的現象，生產的雞蛋會殘留有ASA、ROX等飼料添加劑的問題，但按照建立的方法制備樣品，經HPLC分析，均未有ASA、ROX檢出（表3）。結果表明市售的雞蛋不會對消費者構成危害。

表3 實際樣品測定(mg/kg)Table 3 Actual sample determination(mg/kg)

3 結論

采用QuEChERS試劑盒，聯合高效液相色譜法檢測雞蛋樣品中ASA、ROX的殘留含量。該方法高效、快速、簡便，具有良好的穩定性和精密度。方法檢出限ASA、ROX分別為0.044、0.063 mg/kg；定量限分別為0.149、0.211 mg/kg；相對標準偏差1.54%～5.87%之間。本試驗采用的液相色譜法適用性廣，檢測成本低，且不受樣品揮發性和熱穩定性的限制[24-25]，分析速度快，可應用于其它動物源性食品中ASA和ROX的檢測。