基于UPLC-MS/MS探究烘焙程度對咖啡豆中有機酸含量影響

王東旭，王新財，胡奇杰，王鳳麗，厲 芬，陳褚建

（湖州市食品藥品檢驗研究院，浙江湖州 313000）

咖啡作為世界三大飲料之首，深受各國人民的喜愛[1]。酸度是評價咖啡飲品品質的重要因素之一，而咖啡中的酸度主要來自咖啡豆烘焙過程中產生的酸，烘焙咖啡豆中含有水溶性綠原酸、奎尼酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、醋酸、甲酸、乳酸、甘醇酸等三十多種有機酸以及無機磷酸[2]。研究表明有機酸具有軟化血管、促進微量元素吸收、幫助胃液消化等功能[3]。有機酸的含量受烘焙的溫度及時間影響較大，同時還受咖啡豆的種類影響[4]。與咖啡豆其他有效成分相比，酒石酸、蘋果酸、檸檬酸等有機酸在咖啡豆中含量并不高，其總量約占2.5%[5]，目前對引起咖啡酸味的脂肪族酸含量的報道較少，現有報道主要側重于對烘焙咖啡豆中有機酸檢測方法的報道[2,4,6]，以及烘焙程度對咖啡豆中原有有機酸含量研究[7]。烘焙程度對多種有機酸尤其是新生成的有機酸含量影響還少有研究。有研究表明，蘋果酸和檸檬酸會形成溫和愉悅性的酸味[2]，高溫下綠原酸降解產物奎尼酸會形成咖啡風味中的澀感[8]，奎尼酸降解產物莽草酸是多種芳香化合物的前體物質[9]，因此考察不同烘焙程度下咖啡豆中有機酸含量變化對于烘焙咖啡豆的口感控制極為重要。

目前，有機酸的檢測方法主要有分光光度法[10]、氣相色譜法[11-12]、高效液相色譜法[13-16]、離子色譜法[17-18]和液質聯用法[19-21]等。分光光度計法檢出限較高；氣相色譜法需要衍生處理；高效液相色譜法可測定大多數有機酸，但紫外靈敏度相對較低；而液質聯用法因具有高選擇性和高靈敏度等優點而被廣泛使用[20]。咖啡中的有機酸測定目前還是以液相色譜為主，尚未見到液質聯用技術用于咖啡中有機酸檢測的報道。

本研究以產自洪德拉斯咖啡豆為原料，經過不同程度（輕度、中輕度、中度、中深度、重度、重深度）的烘焙，采用新建立的超高效液質聯用法檢測7種有機酸（富馬酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、莽草酸、奎尼酸、檸檬酸）含量。通過分析有機酸含量變化揭示不同烘焙程度對咖啡豆有機酸成分的影響，研究7種有機酸含量變化的相互關系和烘焙中新生成的有機酸含量變化規律，并對4種咖啡豆（分別產自肯尼亞、印尼、巴西、薩爾瓦多）進行驗證，完成開發基于酸感的烘焙工藝。該研究為進一步深入認識咖啡酸感形成的機制奠定了基礎，也對咖啡豆烘焙產品的開發有較強的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

洪德拉斯SHB咖啡豆 產自洪都拉斯NINFA LANZA莊園；肯尼亞AA++咖啡豆 產自肯尼亞奇雅瓦姆魯魯；印尼羅布斯塔咖啡豆 產自印度尼西亞爪哇；巴西喜拉多咖啡豆 產自巴西喜拉多；薩爾瓦多紅波旁咖啡豆 產自薩爾瓦多Loma La GIoria莊園；琥珀酸（succinic acid，99.5%）、蘋果酸（malic acid，98.0%）、酒石酸（tartaric acid，99.0%）、莽草酸（shikimic acid，98%）、奎尼酸（quinic acid，98.0%）、檸檬酸（citric acid，≥99.5%） 標準品，上海麥克林生化科技有限公司；富馬酸（fumaric acid，99.5%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈（CAN，色譜純）、甲醇（MeOH，色譜純）德國Merck公司；甲酸（色譜純） 上海麥克林生化科技有限公司；試驗用水 為超純水。

ACQUITYTM 超高效液相色譜、XevoTM TQD三重四極桿串聯質譜儀 美國Waters公司；ME204E型電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；Genius 3漩渦混合器 德國IKA公司；KQ-500DB型超聲清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；Allegra X-12R型臺式冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；Simplicity型超純水儀 美國Millipore公司；L9/11/B410型馬弗爐 德國nabertherm公司；JFSD-100型粉碎機 上海嘉定糧油儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 混合對照品溶液的制備 分別稱取富馬酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、莽草酸、奎尼酸和檸檬酸標準物質適量，用水溶液配制成質量濃度均為1.00 mg/mL的單標儲備溶液。再用純水稀釋成質量濃度為10.0 μg/mL的7種有機酸混合標準儲備溶液。各對照品儲備液和混合對照品儲備液均置于4 ℃冰箱中保存。根據需要移取混合標準儲備溶液，配制成濃度分別為50.0、100、500、1000和2000ng/mL的混合標準工作溶液。取1.00 mL標準溶液經0.22 μm水相濾膜后供高效液相串聯質譜檢測。

1.2.2 供試品溶液的制備 隨機選取咖啡豆平鋪一層于坩堝盤中，放入馬弗爐固定位置烘焙。烘焙完成后，立即取出冷卻至室溫。設定烘焙溫度為220 ℃，烘焙時間分別為10、20、30、40、50和60 min，對應的咖啡豆烘焙程度為輕度、中輕度、中度、中深度、重度、重深度。收集烘焙咖啡豆樣品，用粉碎機將咖啡豆粉碎（粒徑1.00 mm），供有機酸含量測定。

稱取1.00 g（精確至0. 01 g）咖啡豆粉置于15 mL離心管中，加入10.00 mL純水，渦旋2 min，超聲20 min，以9000 r/min轉速離心5 min。根據目標物含量再將上述溶液分別用純水稀釋10和500倍，過0.22 μm水相濾膜。按儀器工作條件進行測定。

1.2.3 測定方法 分別精密吸取上述混合對照儲備液各5 μL，注入高效液相串聯質譜儀，測定出峰面積，以濃度（ng/mL）（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制7種有機酸化合物標準曲線圖。精密吸取上述供試品溶液5 μL，注入高效液相串聯質譜儀，測定峰面積，采用外標法定量。

1.2.4 色譜及質譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A為乙腈溶液，流動相B為0.2%甲酸水（v/v，下同）溶液，梯度洗脫程序：0.0～2.0 min，3%A；2.0～2.5 min，3%～30%A；2.5～3.5 min，30%A；3.5～3.6 min，30%～3%A；3.6～7.0 min，3%A；流速0.35 mL/min；進樣體積5 μL；柱溫40 ℃。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI）電離，負離子多反應監測（MRM）模式檢測；毛細管電壓為-2.5 kV；離子源和脫溶劑氣溫度分別為150 和350 ℃；脫溶劑氣和錐孔氣流速分別為800 和50 L/h；碰撞氣為氬氣；7種化合物的定性定量離子對（m/z）、錐孔電壓及碰撞能量等質譜參數見表1。

表1 待測物的監測離子對及最佳質譜參數Table 1 Selected transitions and optimized potentials of the target compounds

1.3 數據分析

采用Origin 9.0軟件進行數據處理和圖表的制作。

2 結果與分析

2.1 液相質譜條件的選擇

文獻[22]表明，因有機酸在反相色譜柱中的保留值較小，酸性物質在高極性流動相（水相比例高）中會存在電離形式和未電離形式，導致色譜圖中同一物質出現多峰和拖尾現象，影響檢測精度；控制流動相pH可以有效調控有機酸的測定形態，避免多峰和拖尾現象。因此，本研究考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液和乙腈-0.2%甲酸溶液等3種流動相對測定的影響。結果表明：7種有機酸類化合物中酒石酸和檸檬酸在乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸溶液條件下，出現明顯拖尾現象，見圖1；而在乙腈-0.2%甲酸溶液作為流動相下，7種有機酸類化合物半峰寬小，峰形對稱尖銳，滿足測試要求。

圖1 液相色譜條件優化Fig.1 Optimization of UPLC conditions

2.2 標準曲線、線性范圍和檢出限

將有機酸混合對照溶液在上述液相質譜條件下進行測定，繪制進樣濃度為橫坐標、定量離子對峰面積為縱坐標的7種有機酸類化合物標準曲線，線性擬合得到線性方程和決定系數，結果見表2。由表2可知，7種有機酸線性擬合良好，決定系數均大于0.990。7種有機酸對照品溶液色譜圖見圖2。由圖2可知，7種有機酸峰形良好，目標峰周圍無雜峰干擾，滿足定量檢測要求。根據信噪比（S/N）=3，計算得到7種有機酸的檢出限，結果見表2。

2.3 回收率和精密度實驗

在烘焙洪都拉斯咖啡豆樣品中分別加入3個濃度梯度的有機酸標準溶液，按上述條件平行測定6次，扣除本底含量后計算加標回收率和相對標準偏差（RSD），結果見表3。由表3可知，采用該研究建立的方法測定7種有機酸的加標回收率為81.9%～104.7%，RSD為0.53%～6.64%。7種有機酸化合物精密度和回收率均滿足定量檢驗需求。

表2 回歸方程和線性范圍Table 2 Linearity parameters and linear ranges of BPs

2.4 烘焙程度及咖啡豆種類因素考察

對7種有機酸在不同烘焙程度下的含量變化進行研究，通過檢測洪德拉斯SHB咖啡生豆在220 ℃溫度下有機酸隨時間變化的含量，得到7種有機酸的含量變化點線圖，結果見圖3。由圖3可知，7種有機酸均有檢出，其中最主要的酸是奎尼酸、檸檬酸和蘋果酸，有機酸含量受溫度因素影響較大。富馬酸含量隨烘焙時間的增加呈現先增加后降低的趨勢，在烘焙40 min時達到最大值，含量為15.47 mg/kg；琥珀酸含量隨烘焙時間的增加而增加，烘焙前30 min含量變化較小，烘焙40 min時開始快速增加，60 min烘焙含量最高；蘋果酸含量隨烘焙時間增加而逐漸降低，烘焙時間越長，蘋果酸含量越低，烘焙40 min后降幅趨于平緩；酒石酸含量隨烘焙時間增加而增加，烘焙60 min酒石酸含量最高，為8.93 mg/kg；莽草酸含量變化較為特殊，前30 min未檢出，30 min之后開始檢出，烘焙60 min達到峰值；奎尼酸含量隨烘焙時間的增加而逐漸升高，20 min后變化幅度較小；檸檬酸含量隨烘焙時間的增加呈現先增加后大幅減少的變化趨勢。根據主要的三種酸檸檬酸、蘋果酸與奎尼酸的含量變化表現可以看出輕度烘焙下，引起愉悅味道的檸檬酸和蘋果酸總量最高，達到1201.5 mg/kg，引起澀味的奎尼酸含量最低，為1363.7 mg/kg，因此輕度烘焙時咖啡豆的酸感最佳。

圖2 有機酸化混合標準溶液色譜圖（50 ng/mL）Fig.2 Chromatograms for the mixed standard solution of organic acids（50 ng/mL）

表3 精密度與回收試驗結果（n=6）Table 3 Results of tests for recovery and precision (n=6)

圖3 洪德拉斯咖啡豆不同烘焙程度下的有機酸含量變化（n=3）Fig.3 Organic acid content of Honduras coffee beans with different roasting (n=3)

圖4 4種咖啡豆不同烘焙程度下的有機酸含量變化（n=3）Fig.4 Organic acid content of 4 coffee beans with different roasting (n=3)

根據7種有機酸含量變化點線圖結合文獻報道[23-24]可以得到有機酸的相互關系和變化規律：蘋果酸中α羥基受熱易脫水轉化為富馬酸，造成蘋果酸含量下降，富馬酸含量上升；奎尼酸可以由綠原酸加熱降解而來，莽草酸則由奎尼酸脫水生成，因此奎尼酸和莽草酸含量雖然都呈現上升趨勢，但是莽草酸上升滯后于奎尼酸；檸檬酸在受熱下則會分解成琥珀酸，造成檸檬酸與琥珀酸含量形成負相互關系；酒石酸則由葡萄糖氧化分解形成，造成含量上升。

基于洪都拉斯咖啡豆中有機酸變化規律和最佳酸度烘焙條件，本研究對市面上常見的其他產地咖啡豆進行了有機酸含量檢測，驗證上述規律及工藝。結果見圖4，4種其他咖啡豆有機酸含量變化趨勢與洪都拉斯咖啡豆相似，但含量有所差異。研究表明巴西喜拉多咖啡豆在中輕度烘焙酸度最高，印尼羅布斯塔咖啡豆則在烘焙過程中酸度最低。比較奎尼酸含量變化圖發現，中輕度烘焙下，印尼羅布斯塔咖啡豆澀度最低；中深度到重深度烘焙過程中，印尼羅布斯塔咖啡豆澀度最高，但四種咖啡豆澀度差異較小。因此，本研究對烘焙過程中咖啡豆中有機酸變化規律具有普適性，滿足咖啡豆的基于酸度口感的烘焙工藝要求。

3 結論

建立了以液質聯用技術檢測咖啡豆中7種有機酸化合物的檢測方法；該方法采用純水作為提取溶劑、采用UPLC-MS/MS在負離子多反應監測（MRM）模式下檢測，外標法定量。該分析方法滿足方法學考察要求，操作簡便，靈敏度好，準確度高，實用性強，為咖啡豆中有機酸含量測定提供了技術支持。咖啡豆的口味受有機酸影響較大，有機酸含量與烘焙條件密切相關，烘焙程度中對咖啡豆中7種有機酸含量影響的研究報道還較少，通過測定在6種烘焙條件下咖啡豆中7種有機酸含量，結果顯示7種有機酸均有檢出，其中最主要的酸是檸檬酸，奎尼酸和蘋果酸。烘焙過程中洪德拉斯咖啡豆，檸檬酸、蘋果酸含量下降，琥珀酸、酒石酸、莽草酸、奎尼酸含量上升，富馬酸含量先增加后降低；以檸檬酸和蘋果酸為指標顯示，在輕度烘焙條件下，酸度口感最佳；考察4種常見產地咖啡豆發現，不同咖啡豆有機酸變化趨勢大體相同，但有機酸含量略有差異，因此調控烘焙程度及咖啡豆產地，可以有效地改變咖啡的酸味及澀味，同時本研究也為改進咖啡烘焙工藝提供了一定的理論依據。