GC-MS法比較分析不同產(chǎn)地川佛手精油成分

王春龍，羅 禹，段靈鑫，韓江云，鄒順梅，張 倩，羅金鳳，張 丹

（西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州 646000）

中藥佛手為蕓香科植物佛手（Citrus medicaL.var.sarcodactylisSwingle）的干燥果實(shí)，其味辛、苦、酸，性溫，歸肝、脾、胃、肺經(jīng)，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰等功效[1]，主治用于肝胃氣滯、胸脅脹痛、胃脘痞滿(mǎn)、食少?lài)I吐、咳嗽痰多等癥。

在《中國(guó)藥典》（2015年版）和其他相關(guān)文獻(xiàn)的記載中，不同產(chǎn)地的佛手均來(lái)源于同一種植物，商品佛手因產(chǎn)地不同有川佛手、廣佛手、金佛手和建佛手之分[2]。據(jù)資料記載，以四川和廣東的佛手種植面積最大，產(chǎn)量最高[3]。《雅州府志》（1739）卷之五·物產(chǎn)篇記載：雅安縣和蘆山縣產(chǎn)佛手、香櫞、柑子[4]，可見(jiàn)佛手在四川的栽培歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)。四川佛手以產(chǎn)量大、質(zhì)量佳，暢銷(xiāo)國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)，形成了佛手的道地品牌川佛手，其適宜于四川盆地邊緣山區(qū)，包括長(zhǎng)江流域上游及岷江流域的沿岸丘陵地區(qū)，主要種植區(qū)有合江、宜賓、沐川、犍為、蘆山、雅安、滎經(jīng)、洪雅、峨眉、夾江[5]及重慶、云南等地[6]。

川佛手作為一味藥食同源的傳統(tǒng)名藥材和四川道地中藥，具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[7]。精油是佛手中主要活性成分之一，在佛手中含量可達(dá)16 mL/kg[8]，其中的有效成分檸檬烯具有抗炎癥[9-10]、抗腫瘤[11-12]、抑菌[13-14]等作用；γ-松油烯具有抗氧化、抗真菌的作用[15-16]等。因其香味清香怡人，令人感到輕松愉悅，在國(guó)外通常被當(dāng)做一種名貴的香料油，并且已經(jīng)在化妝品和食品等行業(yè)廣泛應(yīng)用[17]。

因?yàn)榇ǚ鹗值姆N植區(qū)域廣泛，在不同地理位置和生長(zhǎng)環(huán)境，可能藥材在成分上有所差異，導(dǎo)致其質(zhì)量良莠不齊[18]。目前關(guān)于川佛手的研究報(bào)道多集中于提取純化工藝及提取物的化學(xué)成分分析，為了更好地綜合比較不同產(chǎn)地川佛手精油的異同，本研究采用水蒸氣蒸餾法提取不同產(chǎn)地的川佛手精油，對(duì)其得率進(jìn)行比較；采用氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）比較了不同產(chǎn)地川佛手精油的成分差異，通過(guò)面積歸一化法計(jì)算其精油中共有成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)；采用相關(guān)性分析法及聚類(lèi)分析法進(jìn)行成分的分析和比較，旨在為后續(xù)更好地開(kāi)發(fā)、利用川佛手精油提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10 批川佛手鮮果樣品（編號(hào)：S1～S10） 分別購(gòu)自四川、重慶、云南等地，均于2018～2019 年9～10月份果實(shí)成熟后進(jìn)行采摘，由西南醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室稅丕先教授鑒定為蕓香科植物佛手（Citrus medicaL.var.sarcodactylisSwingle）的新鮮果實(shí)，置于-80 ℃冰箱冷凍待用，其樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1；無(wú)水硫酸鈉 分析純，成都科龍化工試劑廠；蒸餾水實(shí)驗(yàn)室制備。

表1 川佛手鮮果樣品信息來(lái)源Table 1 Sample information of fresh fruit of bergamot

Christ Alpha 1-4 LSCbasic凍干機(jī) 北京博勱行儀器有限公司；Exceed-Cd-10艾柯實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī) 成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司；DB-5MS氣相毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國(guó)安捷倫科技公司；GCMS-QP2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 川佛手精油提取和處理方法 川佛手精油的提取采用水蒸氣蒸餾法，將新鮮川佛手果經(jīng)冷凍干燥后粉碎，過(guò)60 目篩備用。每次稱(chēng)定100.00 g川佛手粉末裝入揮發(fā)油提取裝置，根據(jù)2015版《中國(guó)藥典》（四部）通則“2204揮發(fā)油測(cè)定法”中甲法進(jìn)行提取。隨后將收集的精油（含少量水）進(jìn)行高速離心處理，離心力3000 × g，離心時(shí)間10 min。加入適量的無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行脫水處理。按下列公式計(jì)算川佛手精油得率。

式中：X表示川佛手精油得率，%；m表示精油質(zhì)量，g；M表示川佛手生藥質(zhì)量，g。

最后將制備好的精油置于棕色密封瓶中，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件

1.2.2.1 GC條件 色譜柱：DB-5MS氣相毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：柱箱溫度40 ℃；進(jìn)樣溫度290 ℃；進(jìn)樣口溫度290 ℃，起始溫度40 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升溫至160 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升溫至240 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升溫至290 ℃，保持5 min；載氣（He）流量1.00 mL/min；進(jìn)樣量1.00 μL；分流比10:1。

1.2.2.2 MS條件 質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；離子源溫度200 ℃；接口溫度220 ℃；溶劑延遲時(shí)間2.3 min；質(zhì)量掃描范圍22～600 m/z。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用GC-MS進(jìn)行分析處理，通過(guò)島津氣質(zhì)聯(lián)用工作站GCMS solution工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，將所得的色譜和質(zhì)譜信息經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索與質(zhì)譜檢索庫(kù)NIST14.L進(jìn)行解析并對(duì)照CAS號(hào)，結(jié)合人工譜圖分析確定化合物。按照峰面積歸一化法計(jì)算各化學(xué)成分在川佛手揮發(fā)油中的相對(duì)百分含量。數(shù)據(jù)是利用SPSS Statistics 24.0 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行相關(guān)性分析(Pearson系數(shù))和聚類(lèi)分析（平方歐氏距離），文章中所有數(shù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。圖表采用Excel制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 川佛手精油得率的比較

共測(cè)定10 批不同產(chǎn)地川佛手，每批平行測(cè)定3次，平均精油得率見(jiàn)表2。由表2可知，四川省瀘州市合江縣（S1）的精油得率最高（0.71%），四川省甘孜州瀘定縣（S3）的精油得率最低（0.22%）；四川省宜賓市長(zhǎng)寧縣（S2）、重慶市萬(wàn)州區(qū)（S5）、四川省綿陽(yáng)市安州區(qū)（S6）、四川省綿陽(yáng)市羅江區(qū)（S7）、重慶市梁平區(qū)（S8）的佛手精油得率均不低于0.50%，提示不同產(chǎn)地川佛手的精油含量存在較大差異。

表2 10 批川佛手鮮果樣品的精油得率（±SD，n=3）Table 2 The yield of essential oil of fresh fruit of bergamot from 10 batches (±SD, n=3)

表2 10 批川佛手鮮果樣品的精油得率（±SD，n=3）Table 2 The yield of essential oil of fresh fruit of bergamot from 10 batches (±SD, n=3)

編號(hào) 精油得率（%）S1 0.71±0.03 S2 0.66±0.02 S3 0.22±0.04 S4 0.38±0.03 S5 0.52±0.01 S6 0.60±0.02 S7 0.59±0.04 S8 0.55±0.02 S9 0.46±0.03 S10 0.38±0.02

2.2 川佛手精油成分分析

取“1.2.1”項(xiàng)下供試品適量，按“1.2.2”項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)樣測(cè)定，分別得到各個(gè)產(chǎn)地川佛手精油的總離子流圖，其中圖1為四川省成都市金堂縣樣品（S9）。不同產(chǎn)地川佛手精油分離鑒別情況見(jiàn)表3。不同產(chǎn)地川佛手精油中共鑒別出117 個(gè)成分，其中單萜類(lèi)成分22 個(gè)、倍半萜類(lèi)19 個(gè)、醇類(lèi)35 個(gè)、醛類(lèi) 11個(gè)、酮類(lèi) 7個(gè)、酯類(lèi) 11個(gè)、羧酸類(lèi) 5個(gè)、芳香烴 3個(gè)、酚類(lèi) 3個(gè)、烷烴類(lèi) 1個(gè)。按照峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析，分別求得不同產(chǎn)地川佛手精油各化學(xué)成分的相對(duì)含量結(jié)果見(jiàn)表4。

圖1 川佛手精油（S9）的總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of bergamot essential oil（S9）

表3 不同產(chǎn)地川佛手精油成分分離鑒別情況Table 3 Isolation and identification of bergamot essential oil from different origins

由表4可知，10 個(gè)產(chǎn)地川佛手精油中鑒別出的117 種化學(xué)成分的相對(duì)分子量均在86～294之間，以C10、C12和C15化合物居多，其中相對(duì)分子量為136、152、154、204和222的同分異構(gòu)體所占比例較大，主要為單萜類(lèi)、醇類(lèi)、倍半萜類(lèi)成分。

根據(jù)平均相對(duì)含量對(duì)10 個(gè)產(chǎn)地川佛手精油中鑒別出的117 種化學(xué)成分進(jìn)行排序，其中檸檬烯（38.00%）和γ-松油烯（24.23%）占比超過(guò)了60%，二者為川佛手精油的最主要成分，其他超過(guò)2%的成分還有橙花醛（6.50%）、ρ-傘花烴（4.51%）、香葉醛（3.53%）、檸檬醛（3.18%）、α-松油醇（3.18%）、左旋-β-蒎烯（2.97%）、鄰-異丙基苯（2.71%）、(-)-4-萜品醇（2.59%）、蒎烯（2.56%）、2-異丙烯基-5-甲基己基-4-烯（2.54%）、4-萜烯醇（2.14%）、2-蒈烯（2.08%）。

10 個(gè)產(chǎn)地川佛手精油中有9 個(gè)共有成分，其平均相對(duì)含量由大到小依次為檸檬烯（38.00%）、γ-松油烯（24.23%）、α-松油醇（3.18%）、左旋-β-蒎烯（2.97%）、月桂烯（1.76%）、芳樟醇（0.78%）、α-苧烯（0.77%）、羅勒烯（0.64%）、莰烯（0.06%）；其中7 個(gè)為單萜烯類(lèi)成分，2 個(gè)為醇類(lèi)成分。

表4 不同產(chǎn)地川佛手精油成分相對(duì)含量（%）Table 4 Relative mass fraction of components in bergamot essential oil from different origins (%)

續(xù)表 4

續(xù)表 4

值得注意的是，有一些化學(xué)成分只在個(gè)別產(chǎn)地的樣品中有較高含量，而在其他產(chǎn)地中未檢出，比如鄰-異丙基苯在S1和S2中的含量均超過(guò)2%；ρ-傘花烴在S4、S9和S10中的含量均超過(guò)3%；2-異丙烯基-5-甲基己基-4-烯在S5和S8中的含量均超過(guò)1%；橙花醛在S6、S7和S9中的含量均超過(guò)5%；4-萜烯醇在S1、S2、S3和S5中的含量均超過(guò)1%；(-)-4-萜品醇在S4、S6、S7、S8和S9中的含量均超過(guò)1%；(R)-(+)-β-香茅醇在S5中的含量為1.81%，提示該成分可能和檢出的產(chǎn)地有一定關(guān)系。

2.3 相關(guān)性分析

對(duì)10 個(gè)不同產(chǎn)地川佛手精油的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，以表4中9 個(gè)共有成分的相對(duì)含量為數(shù)據(jù)，組建數(shù)據(jù)矩陣，其Pearson相關(guān)系數(shù)如表5所示。從表5中可知，川佛手精油中α-苧烯與左旋-β-蒎烯呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01)；（+）-檸檬烯與芳樟醇呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01)；α-苧烯與羅勒烯、月桂烯，莰烯與左旋-β-蒎烯、芳樟醇，α-松油醇與芳樟醇呈顯著正相關(guān)（P＜0.05)；（+）-檸檬烯與α-松油醇，γ-松油烯與月桂烯、芳樟醇呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05)。

表5 共有成分相關(guān)性分析結(jié)果Table 5 The results of correlation analysis of common components

2.4 聚類(lèi)分析

對(duì)不同產(chǎn)地川佛手精油的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)，以表4中鑒別出的所有成分百分含量為聚類(lèi)的變量，采用平方歐氏距離(squared Euclidean distance)獲得聚類(lèi)分析譜系圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，10 個(gè)不同產(chǎn)地的川佛手可聚為4 類(lèi)：S1、S2聚為一類(lèi)，S6、S7、S9聚為一類(lèi)，S3、S4、S5、S8聚為一類(lèi)，S10為一類(lèi)。

圖2 不同產(chǎn)地川佛手聚類(lèi)分析譜系圖Fig.2 Pedigree of cluster analysis of bergamot from different origins

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，10 個(gè)不同產(chǎn)地川佛手精油樣品中四川省瀘州市合江縣樣品精油得率最高（0.71%），其次為四川省宜賓市長(zhǎng)寧縣（0.66%）及四川省綿陽(yáng)市安州區(qū)（0.60%）樣品；其化學(xué)成分相對(duì)含量均以(+)-檸檬烯和γ-松油烯較高，其中以四川省瀘州市合江縣樣品中檸檬烯（48.46%）和γ-松油烯（35.39%）的相對(duì)含量最高。這一結(jié)論與文獻(xiàn)[19-21]報(bào)道的新鮮佛手果油的主要成分是檸檬烯和γ-松油烯一致。但同時(shí)也出現(xiàn)與其他研究不一致的情況，如趙永艷等[22]研究發(fā)現(xiàn)全國(guó)范圍10 個(gè)不同產(chǎn)地佛手揮發(fā)油中的主要化學(xué)成分為檸檬烯和萜品烯；黃曉鈺等[23]研究發(fā)現(xiàn)佛手柑果（廣東德慶）外果皮揮發(fā)油成分以苧烯和萜品油烯為主；鄭孝華等[24]研究發(fā)現(xiàn)新鮮佛手果油（浙江金華）的主要成分為α-蒎烯和γ-松油烯。推測(cè)造成各研究間差異的原因可能與佛手品種、不同的采集時(shí)間、精油保存時(shí)間和色譜條件等有關(guān)，但仍有待后續(xù)研究進(jìn)一步探討。

相關(guān)性分析（correlation analysis）是指對(duì)兩個(gè)或多個(gè)具備相關(guān)性的變量元素進(jìn)行分析，旨在研究2個(gè)變量之間的變化趨勢(shì)[25]，從而衡量2個(gè)變量因素的相關(guān)密切程度，本研究對(duì)10 個(gè)不同產(chǎn)地川佛手精油中的9 個(gè)共有成分進(jìn)行了相關(guān)性分析，由相關(guān)性分析結(jié)果可知，左旋-β-蒎烯與α-苧烯呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01)，α-苧烯與羅勒烯、月桂烯；莰烯、α-松油醇與芳樟醇之間顯著正相關(guān)（P＜0.05)，這些化學(xué)成分間相關(guān)性較強(qiáng)，表明此類(lèi)化學(xué)成分可能在川佛手生長(zhǎng)過(guò)程中存在內(nèi)在的相關(guān)關(guān)系。

聚類(lèi)分析作為一種把相似的樣品或變量歸類(lèi)的有效方法，在很大程度上可避免分類(lèi)過(guò)程中夾雜的主觀因素，客觀準(zhǔn)確地反映研究對(duì)象，并從中發(fā)現(xiàn)內(nèi)在的客觀規(guī)律，具有科學(xué)性、客觀性[26]。本文以鑒別出的117 種化學(xué)成分的相對(duì)含量為指標(biāo)對(duì)10 個(gè)不同產(chǎn)地的川佛手精油樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析，聚類(lèi)分析結(jié)果將不同產(chǎn)地分為4 類(lèi): S1（四川省瀘州市合江縣）、S2（四川省宜賓市長(zhǎng)寧縣）歸為一類(lèi)，該類(lèi)特征為(+)-檸檬烯、γ-松油烯和鄰-異丙基苯相對(duì)含量較高；S6（四川省綿陽(yáng)市安州區(qū)）、S7（四川省綿陽(yáng)市羅江區(qū)）、S9（四川省成都市金堂縣）歸為一類(lèi)，該類(lèi)特征為橙花醛相對(duì)含量較高；S3（四川省甘孜州瀘定縣）、S4（四川省雅安市滎經(jīng)縣）、S5（重慶市萬(wàn)州區(qū)）、S8（重慶市梁平區(qū)）歸為一類(lèi)，該類(lèi)特征為香葉醇和芳樟醇相對(duì)含量較高；S10（云南省昆明市宜良縣）單獨(dú)歸為一類(lèi)，該類(lèi)特征為檸檬醛相對(duì)含量較高。把聚類(lèi)分析結(jié)果結(jié)合10 個(gè)川佛手揮發(fā)油產(chǎn)地所處的地理位置信息，由北到南依次為第一類(lèi)（S6、S7、S9）、第二類(lèi)（S3、S4、S5、S8）、第三類(lèi)（S1、S2）、第四類(lèi)（S10），平均緯度分別為31°24’、30°29’、28°70’、24°92’，因此推測(cè)川佛手精油的聚類(lèi)結(jié)果與樣品產(chǎn)地所處緯度有一定關(guān)系，接下來(lái)應(yīng)該對(duì)不同產(chǎn)地多個(gè)批次的川佛手揮發(fā)油進(jìn)行分析，進(jìn)一步探討是否存在這種趨勢(shì)。

綜上所述，本次研究采用GC-MS對(duì)不同產(chǎn)地的川佛手精油進(jìn)行分析比較，對(duì)日后整個(gè)西南地區(qū)川佛手植物資源的種植開(kāi)發(fā)和利用提供新的參考，而且對(duì)于提升川佛手的附加值，將佛手柑加工而成的高品質(zhì)佛手精油深加工并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，具有非常重要的意義。