基于靜態頂空氣相離子遷移譜技術的果啤種類判別

龔 霄，周 偉，李積華, ，涂京霞 ，楊濤華，霍羽佳

（1.中國熱帶農業科學院農產品加工研究所，農業農村部熱帶作物產品加工重點實驗室，廣東湛江 524001；2.海南省果蔬貯藏與加工重點實驗室，廣東湛江 524001；3.廣州珠江啤酒股份有限公司，廣東廣州 510308；4.山東海能科學儀器有限公司GAS事業部，山東德州 251500）

果啤作為一種重要的精釀啤酒產品，兼具啤酒清爽口感和水果的香甜味道，受到越來越多消費者的青睞[1]。我國啤酒市場的果啤產品主要有果味啤酒、果汁啤酒和果釀啤酒三個類型[2]。據報道，啤酒中超過1000種化合物已被鑒定出來，包括如酯、醇、酸、醛、酮、烴、醚、硫化物、脂環族化合物、芳香族化合物、雜環化合物等，它們源自麥汁、啤酒花和酵母等原料本身。制麥及糖化、啤酒花的添加、酵母的酒精發酵等生產工藝都對啤酒最終的香氣和風味有著重要影響[3]。果啤中由于添加的水果原料來源及方式不同，其風味更加多樣化[4]。目前，針對啤酒中揮發性香氣成分的判別研究主要基于電子鼻（electronic nose，EN）[5]、電子舌（electronic tongue，ET）[6]、核磁共 振（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）[7]、GC-MS[8]和GC-O[9]的方法，存在樣品必須經過衍生化處理、色譜柱分離溫度高、分析時間長和受人工經驗的限制等不足之處。離子遷移譜（ion mobility spectrometry, IMS）技術是二十世紀七十年代發展起來的一門新興的化學分析技術，它是以離子化分子在載體緩沖氣體中的遷移率為基礎，在氣相中對其進行分離和識別，然后根據電場中氣相離子遷移速率的差異來表征化學離子物質，最早被用于痕量化學戰劑和非法藥物的探測[10]。鑒于其體積小、靈敏度高、適用范圍廣、分析時間快、樣品前處理簡單，且可在常壓和室溫下工作，近年來在生物化學[11]、藥劑學[12]和食品[13]等諸多領域得到廣泛關注。在食品科學領域，IMS被嘗試用于食品組分分析、加工過程監測、產品風味評價和溯源等方面[14-15]。與傳統GC-MS的方法相比，氣相離子遷移譜（GC-IMS）要求樣品處理及分析的溫度較低，更能反映樣品真實狀態，目前在白酒、黃酒和果酒關鍵香氣物質解析過程中得到廣泛關注[16-19]，但關于啤酒中香氣成分分析的研究未見報道[20]。

本研究選擇菠蘿、蘋果和蔓越莓三種果啤為研究對象，采用靜態頂空氣相離子遷移譜技術構建揮發性有機物（volatile organic compounds，VOCs）的風味指紋圖譜，通過提取差異化合物的特征離子遷移峰，結合主成分分析（principal component analysis，PCA）對不同果啤樣品中關鍵香氣物質進行判別，以期為果啤生產過程的質量控制、產品溯源、品牌鑒定與保護提供新的思路，為進一步闡明不同種類果啤的香氣形成機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿、蘋果和蔓越莓果啤 均為廣州珠江啤酒股份有限公司2019年生產，購自當地超市；Nketones C4～C9標準品 美國AccuStandard公司。

Flavour Spec?食品風味分析與質量控制系統（配有CTC自動頂空進樣器、Laboratory Analytical Viewer（LAV）分 析 軟 件、三 款 插 件（Reporter、Gallery Plot、Dynamic PCA）以及GC × IMS Library Search） 德國G.A.S公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 靜態頂空氣相離子遷移譜（static headspace-gas chromatography-ion mobility spectroscopy，SH-GCIMS）分析 啤酒樣品存放于4 ℃條件下，分析前輕輕打開，在酒體中部快速吸取2 mL并轉移至20 mL體積的頂空進樣瓶中，半旋瓶蓋，置于4 ℃超聲水浴28 kHz下脫氣3 s，停止5 s，再脫氣3 s，以除去CO2。Flavour Spec?風味分析儀頂空進樣體積100 μL；孵育時間5 min；孵育溫度60 ℃；進樣針溫度65 ℃；孵化轉速500 r/min；高純度氮氣為載氣；清洗時間0.5 min。

1.2.2 GC條件 FS-SE-54-CB-1 15 m ID: 0.53 mm石英毛細管柱，柱溫60 ℃；載氣：高純度氮氣（≥99.999%）；載氣流速程序：初始2.0 mL/min，保持2 min，8 min內線性增至100 mL/min，10 min內線性增至150 mL/min，運行時間20 min。

1.2.3 IMS條件 漂移管長度98 mm；管內線性電壓500 V/cm；漂移管溫度45 ℃；漂移氣為高純度氮氣（≥99.999%）；漂移氣流速150 mL/min；放射源為β射線（氚，3H）；離子化N-ketones C4～C9模式：正離子。

1.3 數據處理

每個樣品分析均重復四次。LAV：用于查看分析譜圖，圖中每一個點代表一種揮發性有機物；對其建立標準曲線后可進行定量分析；Reporter插件：直接對比樣品之間的譜圖差異（二維俯視圖和三維譜圖）；Gallery Plot插件：指紋圖譜對比，直觀且定量地比較不同樣品之間的揮發性有機物差異；Dynamic PCA插件：動態主成分分析，用于將樣品聚類分析，以及快速確定未知樣品的種類；GC × IMS Library Search：通過軟件內置的NIST數據庫和IMS數據庫對化合物進行定性分析，其中N-ketones為標準參照物。

2 結果與分析

2.1 不同品種果啤的揮發性化合物GC-IMS圖譜分析

應用SH-GC-IMS技術對菠蘿、蘋果和蔓越莓果啤中的揮發性成分進行分析，得到氣相離子遷移譜圖（圖1），其中，A為揮發性有機物的三維譜圖（保留時間、遷移時間和峰強度），從圖1中可以直觀看出，菠蘿、蘋果和蔓越莓果啤樣品間揮發性有機物存在明顯差異。進一步通過數據的降維處理，得到二維譜圖（B），其中，橫坐標代表離子遷移時間（min），縱坐標代表氣相色譜的保留時間（s）。通過比較離子漂移時間和離子峰強度實現對各組分的定性和相對定量分析。橫坐標8.0處紅色豎線為反應離子峰（RIP峰），RIP峰兩側的每一個信號點代表一種揮發性成分。顏色代表物質的濃度，白色表示濃度較小，紅色表示濃度較大，顏色越深表示濃度越大。

2.2 不同品種果啤的揮發性化合物GC-IMS圖譜分析

根據揮發性成分氣相色譜保留時間和離子遷移時間對果啤揮發性組分進行定性分析，共計確定檢測出35種揮發性化學成分（表1），同一種化合物的單體和二聚體視為一種化合物。這35種物質主要為酯類、醇類、酚類、烯類和醛類，這與文獻中報道的揮發性成分測定結果較一致[21-22]。其中，22種為酯類。

圖1 不同果啤樣品的GC-IMS圖譜Fig.1 GC-IMS chromatogram of different fruit beer samples

2.3 果啤揮發性化合物指紋圖譜比較

為進一步快速對比出不同品種果啤之間風味物質的差異，通過Gallery Plot插件做指紋圖譜對比，在特定果啤的譜圖上選取信號峰，系統生成特征指紋圖譜，該特征指紋圖譜用于鑒別待測樣品是否為特定種類的果啤。由圖2可以看出，乙醇和異戊醇在三種果啤中都存在，異戊醇是啤酒中重要的醇，賦予啤酒水果香味和指甲油氣味[23]。乙酸乙酯、乙酸異戊酯和己酸乙酯在三種果啤中都有較高的濃度，它們賦予啤酒水果味、甜味和花香味[24]。從圖2可以看出，不同果啤揮發性有機物差別較大。菠蘿果啤中，辛酸甲酯、乙酸庚酯、己酸丙酯、庚酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯濃度較高，且酯在菠蘿啤酒中占比最大，與前述文獻報道結果非常吻合[25]。值得注意的是，辛酸甲酯是菠蘿啤酒的特征揮發性物質，它可能來源于菠蘿[26]。蘋果果啤中，乙酸異戊酯、3-甲基戊醇、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、丁醛、庚酸甲酯和2-甲基丁酸甲酯濃度較高，乙酸丁酯是唯一在蘋果啤酒中檢測到的揮發性物質，它賦予啤酒好的風味，對蘋果果啤香氣骨架起到重要支撐作用[27]。蔓越莓果啤中異戊醛、辛酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、丙酸、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、己酸、α-蒎烯、苯乙醛、甲硫基丙醛、水楊酸甲酯和檸檬烯濃度較高，辛酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和己酸在蔓越莓果汁和蔓越莓果酒中都有檢出[28]。根據GC-IMS的指紋圖譜可找到三種果啤中揮發性風味成分的關鍵差異物，通過關鍵差異物質建立特征香氣模型，即可實現不同品種果啤產品的鑒別。

表1 GC-IMS鑒別不同果啤樣品中的揮發性成分Table 1 Identification of volatile compounds in different fruit beers by GC-IMS

圖2 不同果啤樣品中揮發性化合物的指紋圖譜Fig.2 Volatile fingerprints of different fruit beer samples

2.4 果啤特征揮發性化合物的主成分分析

由圖2可以直觀看出不同果啤中揮發性成分差異較大，但不同品種之間的數字化表達沒能實現，需進一步用化學計量方法來確定。因此，運用數理統計分析方法，對不同果啤樣品中的揮發性化合物進行主成分分析和聚類分析，將不同品種果啤的特征差異明顯化，以建立更精準的區分方法。前述三種果啤樣品的PCA得分圖和載荷圖見圖3。由圖3可以看出，乙醇、乙酸異戊酯、己酸乙酯、異戊醇、丁酸乙酯、苯甲醛、辛酸乙酯分布在PC1的正向軸，對PC1（67%）貢獻較大。乙醇、乙酸異戊酯、己酸乙酯、異戊醇、丁酸乙酯、己酸丙酯、庚酸乙酯、辛酸甲酯分布在PC2的正向軸，對PC2（31%）貢獻較大。蘋果果啤和蔓越莓果啤中異戊醇含量較高，菠蘿果啤中己酸乙酯含量相對較高，與圖2結果吻合。三組果啤樣品在得分圖上彼此相距都比較遠，說明離散性良好，關鍵揮發性化合物得到了很好地分離。上述結果表明，采用HS-GC-IMS聯合PCA統計分析方法，能夠很好地辨別菠蘿、蘋果和蔓越莓果啤的香氣類型。

圖3 不同果啤樣品PCA分析的得分圖和載荷圖Fig.3 The score and loading map of PCA analysis of different fruit beer samples

3 結論

采用SH-GC-IMS技術對菠蘿、蘋果和蔓越莓三種果啤進行揮發性化合物組成分析，獲得了不同樣品揮發性化合物指紋譜圖，通過IMS指紋圖譜的二維數據可視化技術篩選出乙醇、乙酸異戊酯、己酸乙酯、異戊醇、丁酸乙酯、苯甲醛、辛酸乙酯等35種揮發性化合物的特征離子峰，作為表征三種果啤產品風味差異信息的特征變量，不同種類的果啤樣品在PCA圖中得到了較好地歸類，兩個主成分累積貢獻率達到98%，可以有效區分三種不同果啤產品的主要香氣。結合聚類分析可辨別出三種果啤揮發性成分之間的主要差異。不同的揮發性成分組成決定了不果啤風味差異，以此可以區分不同種類果啤產品，這為果啤企業實施生產過程控制、產品溯源、品牌鑒定與保護提供了新方法。