1-甲基環(huán)丙烯和不同貯藏溫度對油桃果實硬度與細胞壁果膠的影響

呂真真，劉 慧，張春嶺，劉杰超，楊文博，焦中高

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南鄭州 450009）

油桃，具有特殊的風(fēng)味，營養(yǎng)豐富，含多種維生素、礦物質(zhì)及果酸，深受人們的喜愛[1]。然而油桃采收期相對集中，多在夏季高溫季節(jié)，采后易變軟爛，果實品質(zhì)下降，造成極大損失[2]。因此，質(zhì)地是油桃品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，也是影響油桃果實采后商品價值的最主要因素之一。水果質(zhì)地軟化與果實細胞壁果膠多糖的變化有著密切的聯(lián)系[3]。果膠多糖主要有半乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等中性單糖組成[4]，其中半乳糖醛酸/鼠李糖（Galacturonic acid/Rhamnose，GalA/Rha）、半 乳 糖/鼠 李 糖（Galactose/Rhamnose，Gal/Rha）和阿拉伯糖/鼠李糖（Arabinose/Rhamnose，Arab/Rha）的比值可以表征果膠的聚半乳糖醛酸主鏈、半乳糖支鏈和阿拉伯糖支鏈的多少[5-6]。對冬棗后熟軟化過程中細胞壁多糖降解特性進行研究發(fā)現(xiàn)，冬棗果肉軟化與果膠螯合性和堿溶性多糖組分的降解密切相關(guān)，支鏈的降解促進了果實的軟化[7]。同樣，芒果的軟化與可溶性果膠含量呈極顯著負相關(guān)[8]，藍莓硬度的下降與水溶性果膠含量的升高、堿溶性果膠含量的降低緊密相關(guān)[9]。而在硬溶質(zhì)型桃成熟過程中，Na2CO3-1溶性果膠多糖的降解與硬溶質(zhì)型果實采后軟化密切相關(guān)，富含半乳糖醛酸的果膠多糖主鏈的斷裂可能是果肉軟化的重要因素[10]。然而關(guān)于油桃果實采后質(zhì)地軟化，果膠多糖降解機制研究鮮見。

目前，保持果實質(zhì)地品質(zhì)的方法有很多種，溫控是最常見的貯藏方法之一[11-12]。另外，由于果實的成熟與衰老受乙烯控制，阻止內(nèi)源乙烯的產(chǎn)生或抑制其相關(guān)的生化反應(yīng)，可推遲果實成熟與衰老的進程[13]。研究表明：1-甲基環(huán)丙烯作為一種人工合成的乙烯受體抑制劑，與果蔬組織中的乙烯受體發(fā)生不可逆性結(jié)合，從而阻止乙烯與受體的結(jié)合，抑制乙烯的催熟作用，是一種被廣泛應(yīng)用的果蔬保鮮劑。關(guān)于1-MCP處理果實的報道較多，認為1-MCP 可以延緩蘋果[14]、獼猴桃[15]、梨[16]、桃[17]和菠蘿[18]貯藏期間的質(zhì)地品質(zhì)下降，維持果實質(zhì)地。但是有關(guān)1-MCP處理結(jié)合不同溫度貯藏對油桃果實后熟軟化的影響，特別是在果膠多糖降解方面的報道卻很少。

因此，本研究以油桃品種‘中油 13 號’為試材，通過采取1-MCP、調(diào)節(jié)溫度的保鮮方法延緩細胞壁多糖的降解進程，研究1-MCP和溫度對采后油桃質(zhì)地品質(zhì)及果膠多糖降解特性的影響，以初步闡明油桃貯藏過程中果膠多糖降解規(guī)律，為保鮮方法調(diào)節(jié)油桃果實質(zhì)地變化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中油13號 采自河南省駐馬店市遂平縣豐園紅桃園；1-MCP 有效成分0.14%的粉劑 美國羅門哈斯公司；葡萄糖（99.9%）、半乳糖（99.9%）、甘露糖（99.9%）、阿拉伯糖（99.9%）、木糖（99.9%）、半乳糖醛酸（99.9%）、葡萄糖醛酸（99.9%）、鼠李糖（99.9%）、乳糖（99.9%） 美國Sigma-Aldrich公司；三氟乙酸（99.5%） Aladdin 有限公司，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（99%） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

Jena 50紫外可見分光光度計 德國耶拿分析儀器股份公司；TA-XT2i 型質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems 公司；2515高效液相色譜系統(tǒng) 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理 選用無病蟲害和機械損傷、大小均勻、顏色基本一致帶果柄的油桃，采收當(dāng)天立即運往實驗室。用1-MCP進行密閉熏蒸，處理組濃度為1.0 μL/L，密閉時間為24 h，未經(jīng)1-MCP處理組設(shè)在密閉的空氣中，密閉相同時間。將處理組果實和未經(jīng)處理組果實分別放于低溫（4±1） ℃冷庫和常溫（25±1） ℃環(huán)境中貯藏，每組100個果實，設(shè)置3次重復(fù)。每次試驗隨機取10個果實進行硬度測定，桃果肉去皮切碎后液氮中速凍，放于-80 ℃冰箱以備后續(xù)實驗。當(dāng)腐爛果超過該組果實數(shù)目50%時，結(jié)束該組貯藏。

1.2.2 硬度的測定 硬度采用質(zhì)構(gòu)儀在果實縫合線對稱兩側(cè)中部測定，探頭直徑為 5 mm，探頭以1 mm/s 的穿刺速率下壓，下壓深度為 5 mm，測前速度5 mm/s，測后速度1 mm/s，讀取最大力，除以探頭接觸面積為硬度指標(biāo)。

1.2.3 果膠類物質(zhì)的提取 桃果實中細胞壁物質(zhì)的提取參照Liu等[19]的方法進行，略有改動。稱取30 g果肉組織，加液氮快速研磨，取7.5 g研磨后果肉于50 mL離心管中，加入5倍80%乙醇，煮沸20 min，除去糖分和其他物質(zhì)，冷卻至室溫后，8000 r/min，離心10 min，棄上清，重復(fù)兩次。沉淀用30 mL 90%二甲基亞砜浸泡冷藏過夜，12000 r/min離心20 min，棄上清，沉淀依次用三氯甲烷：乙醇（2:1）、丙酮溶液沖洗。最后濾渣在室溫下真空干燥3 d，得細胞壁物質(zhì)。

稱取75 mg細胞壁物質(zhì)，加入15 mL 50 mmol/L醋酸鈉緩沖液（pH 6.5），室溫振蕩5 h，12000 r/min離心20 min，取上清得水溶性果膠（WSP）溶液；沉淀中加入15 mL含50 mmol/L EDTA的 50 mmol/L醋酸鈉緩沖液（pH 6.5），室溫振蕩5 h，12000 r/min離心20 min，取上清液得螯合性果膠（CSP）溶液；沉淀中加入15 mL的 50 mmol/L碳酸鈉溶液（含2 mmol/L EDTA），室溫振蕩5 h，12000 r/min離心20 min，上清液為碳酸鈉可溶性果膠（SSP）溶液。

1.2.4 果膠含量的測定 果膠含量測定采用間羥基聯(lián)苯比色法[20]。取提取果膠液10倍稀釋液1 mL，于20 mL 具塞試管，置冰水浴中，加入四硼酸鈉/硫酸溶液5 mL，用旋渦混合器混勻，于沸水浴中加熱5 min，冰水浴中冷卻后加入 1.5 mg/mL間羥基聯(lián)苯溶液100 μL，混勻后振搖 5 min，超聲除去氣泡。以1 mL蒸餾水同上操作制得空白液調(diào)零，在524 nm處測定吸光度。以D-半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品按上述方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=9.6314x-0.0056，R2=0.9989。油桃的WSP、CSP 和 SSP 含量以每 100 g 鮮果中含D-半乳糖醛酸毫克數(shù)表示（mg D-半乳糖醛酸/100 g）。

1.2.5 果膠鏈中單糖的組成分析 參照張鵬龍[21]的方法，采用柱前衍生高效液相色譜法測定果膠鏈的單糖組成，并對各組成單糖進行定量分析。

混合單糖標(biāo)樣的衍生：取 500 μL 的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液（葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、鼠李糖、乳糖，濃度均為8 mmol/L）于離心管中，加入250 μL 的 0.3 mol/L NaOH 溶液，再加250 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液（甲醇重結(jié)晶兩次），漩渦混勻，在 70 ℃恒溫水浴中反應(yīng) 100 min，取出放置 10 min冷卻至室溫后，再加250 μL 的 0.3 mol/L 的 HCl 中和，再加等體積的氯仿，振搖，靜置，棄去氯仿相，重復(fù)兩次。將水相用0.45 μm 微孔膜過濾后供 HPLC進樣分析。

樣品制備：取8 mL經(jīng)過透析的果膠提取液，將其冷凍干燥為固體，然后加入 2 mL的 2 mol/LTFA,在 120 ℃條件下水解 2 h，冷卻后再將水解液冷凍干燥為固體。然后按照混合單糖標(biāo)樣衍生的方法進行衍生化處理。

透析條件：4 ℃蒸餾水透析 24 h（透析袋截留分子量：3500 Da），中間需多次換水,提取液透析前需調(diào)至pH6.0。

色譜條件：色譜柱：ZORBAX Eclipse XDBC18分離柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：溶劑A：0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.9）：乙腈（85:15），溶劑B: 0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.9）：乙腈（60:40）；流速：1 mL/min；檢測波長：250 nm；柱溫：25 ℃；時間梯度：0→10→30 min；濃度梯度：0→10%→25%溶劑B；進樣量：10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003和SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗設(shè)置3次重復(fù)，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 采后1-MCP處理和溫度對油桃果實硬度影響

從圖1可以看出，隨著貯藏時間的延長各組油桃果實硬度均呈下降趨勢。常溫貯藏油桃硬度下降迅速，貯藏至第2 d和第4 d，1-MCP處理組油桃硬度分別下降12.31%和54.53%，相同溫度下未經(jīng)1-MCP處理組硬度分別下降了57.48%和68.13%。表明1-MCP處理能有效地抑制油桃果實硬度的下降。但4 d之后油桃迅速軟化，至貯藏第8 d，1-MCP處理油桃硬度下降85.83%，未經(jīng)1-MCP處理組硬度下降85.36%，兩者之間沒有顯著差異（P＞0.05）；低溫貯藏油桃硬度下降緩慢，貯藏至結(jié)束，1-MCP處理組油桃硬度下降54.38%；相同溫度下未經(jīng)1-MCP處理組硬度下降了62.96%。1-MCP處理能有效地抑制油桃果實硬度的下降，而且抑制效果顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，對比常溫貯藏，低溫貯藏延緩油桃硬度下降效果顯著；1-MCP處理油桃果實在常溫貯藏前期能有效抑制果實硬度下降，但貯藏后期抑制效果降低；1-MCP處理結(jié)合低溫貯藏延緩果實硬度下降的效果較好。

圖1 采后1-MCP處理和溫度對油桃果實硬度的影響Fig.1 Effects of 1-MCP treatment and temperature on firmness of post-harvest nectarine

2.2 采后1-MCP處理和溫度對油桃果膠含量及果膠鏈單糖比值變化影響

2.2.1 對油桃WSP含量及其主側(cè)鏈單糖比值影響由圖2可知，常溫下，油桃WSP含量均呈上升趨勢，在貯藏第8 d達到最大值，未經(jīng)1-MCP處理和1-MCP處理組分別為（282.13±12.14） mg/100 g和（328.90±9.37） mg/100 g，差異極顯著（P＜0.01）；而在貯藏前4 d 1-MCP處理油桃WSP含量低于未經(jīng)1-MCP處理WSP含量，4 d之后1-MCP處理油桃WSP含量高于未經(jīng)1-MCP處理WSP含量。低溫下的油桃WSP含量呈先上升后下降趨勢，比常溫貯藏下含量低，且變化速率慢；1-MCP處理組WSP含量極顯著低于未經(jīng)1-MCP處理WSP含量（P＜0.01），分別在第6 d和12 d達到最大值。低溫貯藏下WSP含量先增加后減少在大多數(shù)果實成熟中發(fā)生，包括杏[19]、櫻桃[22]等。這可能是由于原果膠在貯藏前期增溶，多聚醛酸鏈斷裂，分解為可溶性果膠，所以WSP含量增加，后在各種酶作用下被分解成小分子物質(zhì)，為呼吸作用提供底物，造成WSP含量減少，并且低溫可以降低酶促反應(yīng)速率，抑制WSP含量的變化[21]。

圖2 采后1-MCP處理和溫度對油桃果實WSP含量影響Fig.2 Effects of 1-MCP treatment and temperature on WSP content of post-harvest nectarine

由圖3可知，常溫貯藏下，未經(jīng)1-MCP處理與1-MCP處理油桃WSP主鏈GalA/Rha、支鏈Gal/Rha呈波動升高趨勢，支鏈Arab/Rha呈先下降后升高趨勢。常溫貯藏前4 d，處理組油桃GalA/Rha與Arab/Rha顯著低于未經(jīng)1-MCP處理組。4 d之后，處理組普遍比對未經(jīng)處理組高，說明常溫貯藏前期1-MCP處理能有效地抑制WSP 半乳糖醛酸主鏈與阿拉伯支鏈的變化。低溫貯藏下，未經(jīng)1-MCP處理油桃WSP主鏈GalA/Rha與支鏈Gal/Rha大致呈先升高后下降趨勢，除個別取樣點處理組油桃WSP支鏈Arab/Rha與Gal/Rha比未經(jīng)處理組高外，處理組油桃WSP主鏈GalA/Rha、支鏈Arab/Rha與Gal/Rha均比未經(jīng)1-MCP處理低，說明低溫貯藏下1-MCP處理對油桃WSP主側(cè)鏈含量變化有抑制作用。

圖3 采后1-MCP處理和溫度對油桃WSP主側(cè)鏈單糖比值變化影響Fig.3 Effects of 1-MCP treatment and temperature on changes in the monosaccharide ratio of WSP main and side chain of post-harvest nectarine

2.2.2 采后1-MCP處理和溫度對油桃CSP含量及其主側(cè)鏈單糖比值影響 由圖4可知，常溫貯藏前4 d，未經(jīng)1-MCP處理和1-MCP處理油桃CSP含量變化緩慢，4 d之后呈上升趨勢，第8 d達到最大值，分別為（113.97±0.62） mg/100 g和（137.36±0.89） mg/100 g，差異極顯著（P＜0.01）。這可能是由于CSP是以螯合劑提取的以Ca2+交聯(lián)的果膠，在果實的貯藏過程中，WSP和SSP在果膠甲酯酶的作用下脫甲酯化，促進交聯(lián)積累更多的CSP[23]。低溫下油桃CSP含量均呈重復(fù)下降升高的趨勢，整體較常溫貯藏下含量低，未經(jīng)1-MCP處理和1-MCP處理油桃CSP含量在貯藏第12 d時達到最高值。常溫與低溫下1-MCP處理油桃果實CSP含量均比對未經(jīng)1-MCP處理的高，這說明1-MCP處理能促進油桃果實CSP的積累，延緩其分解，延緩果實軟化。

圖4 采后1-MCP處理和溫度對油桃果實CSP含量的影響Fig.4 Effects of 1-MCP treatment and temperature on CSP content of post-harvest nectarine

由圖5可知，常溫貯藏下，未經(jīng)1-MCP處理與1-MCP處理油桃CSP主鏈GalA/Rha呈波動升高趨勢，支鏈Arab/Rha呈先升高后下降趨勢，常溫貯藏前2 d，1-MCP處理組支鏈Arab/Rha與Gal/Rha比未經(jīng)1-MCP處理高，說明在常溫貯藏前期1-MCP處理能有效地抑制CSP阿拉伯糖支鏈與半乳糖支鏈的變化。低溫貯藏下，油桃CSP主鏈GalA/Rha與支鏈Arab/Rha呈先升高后下降趨勢，主鏈GalA/Rha在貯藏第6 d時達到最高值，支鏈Arab/Rha在貯藏第18 d時達到最高值，這是因為果膠主鏈的大量斷裂與果實軟化的啟動有關(guān)，所以油桃CSP主鏈GalA/Rha最高峰出現(xiàn)較早；阿拉伯糖的主要降解時期和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性最大的時期主要是出現(xiàn)在桃果實采后貯藏的后期[24]，所以油桃CSP支鏈Arab/Rha最高峰出現(xiàn)較晚；1-MCP處理組CSP支鏈Arab/Rha與Gal/Rha比未經(jīng)1-MCP處理高（除去第24 d），減緩阿拉伯支鏈的分解，延緩油桃果實軟化。

圖5 采后1-MCP處理和溫度對油桃CSP主側(cè)鏈單糖比值變化的影響Fig.5 Effects of 1-MCP treatment and temperature on changes in the monosaccharide ratio of CSP main and side chain of post-harvest nectarine

2.2.3 采后1-MCP處理和溫度對油桃SSP含量及其主側(cè)鏈單糖比值影響 SSP 主要存在于中膠層中，起到細胞間的粘連作用。由圖6可知，常溫貯藏下，未經(jīng)1-MCP處理與1-MCP處理油桃果實SSP含量呈先增加后減少的趨勢，在貯藏前2 d，SSP含量急劇增加，并出現(xiàn)高峰值分別為（230.04±7.11） mg/100 g和（353.38±7.50） mg/100 g，差異極顯著（P＜0.01），2 d之后快速下降，在貯藏結(jié)束時分別為（91.86±7.79）mg/100 g和（130.82±8.44） mg/100 g，差異極顯著（P＜0.01）。低溫貯藏下，未經(jīng)1-MCP處理與1-MCP處理油桃SSP含量逐漸下降，在貯藏結(jié)束時分別為（119.40±6.14） mg/100 g和（119.34±0.13） mg/100 g，差異不顯著（P＞0.05），且其下降速率明顯比常溫貯藏下緩慢。常溫與低溫下1-MCP處理油桃果實SSP含量均比未經(jīng)1-MCP處理果實的含量高，說明1-MCP處理與低溫貯藏有助于延緩SSP的降解。

圖6 采后1-MCP處理和溫度對油桃果實SSP含量的影響Fig.6 Effects of 1-MCP treatment and temperature on SSP content of post-harvest nectarine

由圖7可知，常溫貯藏下，1-MCP處理組與未經(jīng)1-MCP處理組油桃SSP支鏈中Arab/Rha變化呈先升高后下降，支鏈Gal/Rha大致呈下降趨勢，未經(jīng)1-MCP處理組主鏈GalA/Rha呈先下降后升高趨勢，1-MCP處理組呈下降趨勢，此處與闞娟等[17]測得桃果實 Na2CO3溶性果膠中主側(cè)鏈變化結(jié)果一致。1-MCP處理組SSP中Arab/Rha均比未經(jīng)1-MCP處理高，減緩阿拉伯支鏈的分解，延緩油桃果實軟化。低溫貯藏下，側(cè)鏈Ara/Rha與Gal/Rha的變化與SSP多糖的變化趨勢一致，大致呈下降趨勢，1-MCP處理組SSP中Arab/Rha與Gal/Rha均比未經(jīng)1-MCP處理含量高，減緩阿拉伯支鏈與半乳糖支鏈的分解，延緩油桃果實質(zhì)地軟化。

3 討論與結(jié)論

1-MCP 與乙烯競爭受體，并與之緊密結(jié)合，抑制乙烯與其受體的正常結(jié)合，阻斷乙烯反饋調(diào)節(jié)的生物合成，達到延緩果實衰老的效果。本研究結(jié)果顯示，在常溫貯藏下，1-MCP處理油桃能有效抑制果實硬度下降，但貯藏后期抑制效果降低，說明經(jīng)1-MCP處理的果實軟化進程推遲，但最終果實仍可正常成熟和軟化。同樣，1-MCP能延緩常溫貯藏下軟溶質(zhì)桃貨架期前期硬度下降，并推測1-MCP可能主要通過調(diào)控endo-PG家族基因中Prupe.4G261900來延緩軟溶質(zhì)貨架期前期硬度的降低[25]；低溫貯藏下，1-MCP處理延緩油桃果實硬度下降的效果更佳。

采后果蔬質(zhì)地特性的變化通常認為是細胞壁復(fù)雜結(jié)構(gòu)的變化，其中尤以果膠多糖為主，雙子葉植物中果膠約占細胞壁物干重的35%，是組成細胞壁中膠層的主要生物大分子[26]。果膠質(zhì)在果蔬成熟之前呈不溶狀態(tài)，即原果膠，使果肉質(zhì)地堅強，細胞結(jié)構(gòu)完整。果膠的溶解是最根本和最重要的果實軟化特征。果實成熟時果膠的變化主要包括果膠的去酯化和長鏈的去聚化[27]。在貯藏過程中不溶性的原果膠降解成可溶性的果膠和果膠酸，使初生壁解體，細胞間的粘合力降低，細胞分區(qū)消失而失去膨壓，導(dǎo)致果實硬度下降[22]。Liu[19]、張鵬龍[21]、闞娟[17]等分別研究發(fā)現(xiàn)采后杏、櫻桃番茄、桃的貯藏品質(zhì)與果膠多糖含量及結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。本文研究了1-MCP處理結(jié)合不同溫度貯藏條件下油桃果膠多糖含量的變化規(guī)律及降解特性，分析了不同貯藏條件下果實軟化與果膠多糖降解的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，油桃果實的質(zhì)地軟化與果膠多糖的含量及主側(cè)鏈變化密切相關(guān)。常溫貯藏下，1-MCP通過影響前期油桃WSP半乳糖醛酸主鏈和阿拉伯糖支鏈的積累、CSP阿拉伯糖支鏈與半乳糖支鏈的分解以及整個過程中油桃SSP阿拉伯糖支鏈的分解，抑制了WSP含量的升高與CSP和SSP含量的降低，延緩油桃軟；低溫貯藏下，油桃果實硬度的變化趨勢與SSP含量以及其側(cè)鏈Ara/Rha支鏈與Gal/Rha支鏈的變化趨勢一致，這與張麗芬發(fā)現(xiàn)的桃貯藏過程中硬度與其SSP含量有很大相關(guān)性一致[28]，這說明低溫主要通過抑制SSP阿拉伯糖支鏈與半乳糖支鏈的分解，減緩SSP含量降低，來延緩油桃軟化。一些酶的作用在果實成熟與貯藏過程中對細胞壁多糖分子的降解起著重要的作用，因此油桃貯藏過程中細胞壁降解酶的活性變化以及酶對細胞壁多糖分子微觀結(jié)構(gòu)作用的過程及機理有待進一步研究。

圖7 采后1-MCP處理和溫度對油桃SSP主側(cè)鏈單糖比值變化的影響Fig.7 Effects of 1-MCP treatment and temperature on changes in the monosaccharide ratio of SSP main and side chain of post-harvest nectarine

1-MCP處理能有效地抑制常溫下油桃果實硬度下降，主要通過延緩油桃WSP半乳糖醛酸主鏈和阿拉伯糖支鏈的積累、CSP與SSP阿拉伯糖支鏈與半乳糖支鏈的分解，抑制油桃水溶性果膠含量的升高與螯合性果膠和堿溶性果膠含量的降低，延緩油桃軟化；但貯藏后期抑制效果減弱。1-MCP結(jié)合低溫貯藏效果更好，低溫能夠抑制SSP阿拉伯糖支鏈與半乳糖支鏈的分解，減緩堿溶性果膠含量的降低，延緩油桃軟化。