碭山酥梨膜結合態與可溶態多酚氧化酶性質比較

胡月恒，劉 芳

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100）

果蔬中的褐變以多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）引起的酶促褐變反應最為明顯[1-4]。PPO在細胞內有兩種存在形式：可溶態（sPPO）和膜結合態（mPPO）[5]。正常情況下，sPPO以可溶的形式存在于細胞質中，mPPO結合在質體、線粒體、葉綠體等細胞器膜和細胞膜或細胞壁上[6]，PPO基因在細胞質中合成含有轉運肽的前體肽，分子質量一般為60～75 ku，隨后前體肽被轉運肽轉運至質體的內囊體膜上，即為mPPO。mPPO被分解成分子質量約為45～69 ku的成熟肽，即為sPPO。在貯藏初期，果實的PPO主要以mPPO形式存在，隨著貯藏時間的延長，當細胞膜結構遭到破壞以后，mPPO便從細胞膜上脫離，并向sPPO轉化，表現PPO的催化活性[7]。或在某些外界刺激下，如鮮切處理、超高壓處理梨汁及非濃縮還原果汁時，其活性受到激發，表現出高活性[8]。隨著分子生物學、細胞生物學、分子遺傳學等學科的發展，PPO褐變機制研究逐步向分子水平深入[9-11]。但mPPO在褐變中的作用及其激活機制尚不明確。前期對sPPO性質研究較多[12]，而碭山酥梨mPPO的研究暫時空白。

碭山酥梨屬于白梨系統，是我國果品中的名優產品。該品種以果大、核小、黃亮、形美、皮薄、多汁、果肉細膩、甘甜酥脆等特點馳名中外，深受國內外消費者青睞，是我國出口創匯的主要梨品種之一[13-14]。但碭山酥梨采后的生理病害—黑皮病，嚴重影響它的經濟價值。且鮮切處理、超高壓處理梨汁及非濃縮還原果汁時，多酚氧化酶活性出現上升，是由于sPPO結構變化還是因為mPPO被激活，具體原因尚不明確。本文以碭山酥梨為原料，采用超聲處理結合溫度誘導的方法提取mPPO，對mPPO的性質進行研究，并與sPPO催化特性進行比較，為mPPO在碭山酥梨褐變中的作用及機制研究奠定基礎，為其加工過程中褐變控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

碭山酥梨 購自陜西楊凌，挑選形狀規則、無機械傷、無綠變、大小均勻的酥梨為實驗材料，洗凈，4 ℃貯藏；Triton X-100、PMSF、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白 北京索萊寶生物科技有限公司；鄰苯二酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、Tris、HCl、檸檬酸、醋酸、磷酸 北京金銳林生物科技有限公司。

FE20-KpH計 梅特勒-托利多公司；紫外可見分光光度計（T6 spectrophotometer） 北京普析通用儀器有限公司；HW.SY11-K電熱恒溫水浴鍋 北京醫療設備廠；DW-HL328低溫冰箱 北京中科美菱公司；CI7600色度儀 愛色麗（上海）色彩科技有限公司；TGL 16-C高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 碭山酥梨mPPO分離提取 碭山酥梨mPPO提取方法參考Bravo等[1]以及劉芳[12]的mPPO提取方法略有修改。將碭山酥梨洗凈、切塊，分別加入0.05 mol/L的4 ℃預冷PBS緩沖溶液（pH6.80、含2% PVPP，PMSF），料液比為體積比1:1，攪打30 s后離心15 min（11000 r/min），所得濾液棄去。濾渣加入150 mL Tris-HCl緩沖液（含0.25% Triton X-100）勻漿30 s，60 W超聲處理10 min后靜置30 min。4 ℃下11000 r/min離心15 min后，置于冰箱30 min，然后35 ℃水浴保溫15 min。25 ℃下離心15 min，上清液即為mPPO粗提液。mPPO粗提液進行60%～80%硫酸銨分級沉淀，收集沉淀，用0.05 mol/L PBS緩沖液溶解透析24 h（4 ℃）。透析結束后，離心20 min（9000 r/min，4 ℃），收集上清液經DEAE Sepharose Fast Flow層析0.1 mol/L NaCl梯度洗脫，將所得mPPO酶活高的組分收集備用。

1.2.2 碭山酥梨sPPO分離提取 碭山酥梨sPPO提取方法參考劉芳[12]中sPPO提取方法。

1.2.3 蛋白質含量測定 采用Bradford法[15]進行蛋白含量測定。以牛血清蛋白（BSA）標準品作為標準蛋白，繪制標準曲線。根據標準曲線計算樣品中蛋白質的濃度。標準曲線方程：Y=0.0055X - 0.0048（R2=0.999）。

1.2.4 酶活測定 以鄰苯二酚為反應底物，將0.5 mL酶液和2.5 mL的鄰苯二酚底物溶液混合，在25 ℃下用分光光度計測定混合液在1 min內在特征吸收波長下的吸光值的變化。一個酶活力單位（IU）為在測定條件下1 s內吸光值的改變。酶的比活力為酶活與酶液蛋白含量的比值。

1.2.5 米氏常數測定 分別配制濃度為0.00625、0.0125、0.0250、0.0500、0.100和0.150 mol/L的鄰苯二酚溶液。測定不同底物濃度下mPPO的活性。參照Lineweaver-Burk作圖法，繪出的直線，縱坐標值即為1/Vmax，橫截距即為1/Km，即Km=-1/X。

1.2.6 最適反應pH及酸堿穩定性的測定 配制0.05mol/L的醋酸鈉緩沖溶液（pH3.50、pH4.00、pH4.50、pH5.00、pH5.50），0.05 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH6.00、pH6.50、pH7.00、pH7.50），0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH8.00、pH8.50）。

最適反應pH：用不同pH的緩沖液配制濃度為0.2 mol/L的鄰苯二酚溶液。按照1.2.4酶活測定方法測定在不同pH條件下mPPO和sPPO的活性，計算比活力。

酸堿穩定性：將酶液與不同pH緩沖液按體積比1:4混合，24 h后，測定mPPO和sPPO活性。以磷酸緩沖液（0.05 mmol/L，pH6.80）中酶液的活性為原始活性，并計算不同pH緩沖液下mPPO和sPPO活性與原始酶活的百分比，做為相對活性。

1.2.7 最適反應溫度的測定 用緩沖溶液(0.05 mol/L，pH6.80)配制0.2 mol/L的鄰苯二酚溶液，分別置于溫度為25～85 ℃（每個處理間隔10 ℃）水浴槽中預熱。在未添加mPPO之前，先在各設定溫度下預熱15 min，然后迅速加入酶液，混勻。按照1.2.4酶活測定方法分別測定各溫度下的mPPO和sPPO活性，計算比活力。

1.2.8 溫度穩定性的測定 將mPPO酶液置于溫度為25～75 ℃（每個處理間隔10 ℃）的水槽中，分別水浴10、20、30、40、50、60 min后，測定不同溫度下mPPO和sPPO的活性。

1.2.9 熱失活動力學參數的計算 碭山酥梨sPPO及mPPO熱失活動力學參數計算方法參考Ioni??等[16]中的計算方法。失活動力學參數計算公式如式（1）～式（5）所示。

式中，A代表酶活；A0代表初始酶活；k為熱失活速率（min-1）；D為指數遞減時間（min），即在設定的溫度下，酶活降低90%所需要的時間；ZT表示D值對溫度的敏感性（℃），即D值變化一個對數時對應的溫度的變化；T為絕對溫度（K）；t1/2是失活半衰期（min）；Ea失活活化能（kJ/mol）；R為常數8.314（J/mol/K）。

1.3 數據處理

利用SPSS 20.0和Origin 8.0軟件進行數據統計分析及作圖，每個實驗重復3次，數據均以平均值±標準差（meana±SD）表示。采用鄧肯式多重差異比較，當P＜0.05時，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 比活力比較

酶的比活力為酶活與酶液蛋白含量的比值。mPPO與sPPO比活力結果如表1所示。從表1中可看出，當以鄰苯二酚為底物時，碭山酥梨sPPO酶活高于mPPO。這與Webb等[17]研究結果一致。果蔬中存在不同的PPO亞型，且PPO在不同條件下表達量不同，所以不同果蔬中mPPO與sPPO的比活力差異很大。Tsurutani等[18]發現某些蘋果品種sPPO活性明顯高于其他蘋果品種中的潛伏態PPO。Sellés-Marchart等[19]發現以綠原酸為底物時，mPPO活性比sPPO更高。

表1 碭山酥梨sPPO和mPPO比活力比較Table 1 The specific activity of sPPO and mPPO from Dangshan pear fruit

2.2 米氏常數比較

米氏常數結果如圖1和圖2所示。

圖1 底物濃度對反應速率的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on reaction rate

圖2 底物濃度與反應速率倒數圖Fig.2 Lineweaver-Burk plot

當以鄰苯二酚為底物時，計算可得Km(sPPO)為0.062 mol/L，Km(mPPO)為0.023 mol/L。這與其他果蔬中以鄰苯二酚為底物時的Km值研究結果一致，比如葡萄PPO（Km=52.6 mmol/L），杏PPO（Km=61 mmol/L）[20]。Km可表示酶對底物親和力的大小，從二者的Km值可看出，mPPO對鄰苯二酚的親和力更強，更易催化底物發生褐變。

2.3 最適反應pH比較

sPPO與mPPO最適反應pH如圖3所示。sPPO在pH5.00出現酶活高峰，而當pH為4.50時，mPPO活性最高，明顯高于其他pH時的酶活。mPPO在pH7.00時有一個酶活小峰，這可能與其結構相關，有研究表明富士蘋果mPPO在其結構中存在一段未知功能區域，但其功能尚未明確[12]。在以往研究文獻中，也有類似結果。George等[21]研究發現以鄰苯二酚為底物時，鱷梨最適pH為5.0和7.0，這與本研究結果一致。文獻報道中果蔬最適pH大多處于4.0～8.0之間[22]。這可能與底物、酶的活性中心、酶與底物形成的復合物存在不同的電離狀態等有關[23]。

2.4 酸堿穩定性比較

碭山酥梨mPPO與sPPO的酸堿穩定性如圖4所示。從圖4中可看出，mPPO酸堿穩定性較好，在pH3.50～4.50時，24 h后酶活高于原酶活，其中在pH4.50時，24 h后酶活為原酶活的375.40%。這可能是由于在此區間內mPPO構象變化，活性中心暴露，更易與底物結合。在pH6.5時，24 h后mPPO酶活為原酶活的90.08%。pH6.50～7.50時，sPPO酶活穩定性較好，其中pH7.0，24 h后酶活最高，為原酶活的45.33%。與sPPO相比較，mPPO酸堿穩定性較高，這可能與其生理功能相關，但mPPO在果蔬采后生理中的作用及機制尚無深入研究。對mPPO在果蔬采后生理中的作用及機制研究有助于揭示果蔬采后貯藏保鮮及鮮切果蔬加工過程中的褐變機理，這將是mPPO今后的研究熱點。

圖3 pH對碭山酥梨mPPO及sPPO比活力的影響Fig.3 Effects of pH on the specific activity of mPPO and sPPO from Dangshan pear fruit

圖4 pH對碭山酥梨mPPO及sPPO穩定性的影響Fig.4 Effects of pH on the stability of mPPO and sPPO from Dangshan pear fruit

2.5 最適反應溫度比較

最適反應溫度測定結果如圖5所示。從圖5中可以看出，mPPO最適溫度高于sPPO。當溫度為35～45 ℃時，mPPO活性最高。在45～55 ℃區間內，酶活下降稍為緩慢，當溫度超過達到55 ℃后，酶活迅速下降。當溫度達到85 ℃時，酶活性接近為零。sPPO在35 ℃的活性最高。隨著溫度的升高，sPPO活性下降迅速。果蔬PPO最適溫度呈現很大差異，這不僅與其來源相關，與其在果蔬中的存在形式及狀態也密切相關。比如蛇皮果mPPO最適溫度為30 ℃[24]，枇杷果實潛伏態PPO最適溫度為70 ℃[19]，這與PPO在果蔬中參與抵御外界傷害的功能有關。

圖5 溫度對碭山酥梨mPPO及sPPO比活力的影響Fig.5 Effects of temperature on the specific activity of mPPO and sPPO from Dangshan pear fruit

2.6 溫度穩定性比較

sPPO及mPPO 溫度穩定性及失活速率曲線如圖6、圖7所示。從圖6（a）可以看出，sPPO在25、35 ℃水浴時活性下降不明顯，穩定性較好。在45～65 ℃時殘余活性隨著水浴時間的延長而降低，熱穩定性迅速下降。75 ℃水浴10 min時活性幾乎為零。從圖7(a)可以看出，當加熱10 min時，mPPO活性隨溫度升高而升高，75 ℃加熱10 min后，mPPO活性顯著高于其他加熱溫度的酶活（P＜0.05）。當溫度低于55 ℃時，mPPO熱穩定性較好，超過55 ℃后酶活下降迅速。

圖6 碭山酥梨sPPO熱穩定性（a）及失活速率（b）曲線Fig.6 Thermal stability (a) and thermal inactivation rate (b) of sPPO from Dangshan pear fruit

為了進一步的研究sPPO及mPPO耐熱性的差異，實驗比較了兩者的失活動力學參數。sPPO及mPPO在不同溫度下熱失活后，將酶活取對數，即ln（A/A0），并與失活時間t進行線性擬合，確定其失活動力學模型。由圖6（b）、圖7（b）可知，sPPO及mPPO失活時間t與殘留酶活的對數ln（A/A0）在各溫度下均呈線性關系（決定系數R2＞0.946），表明sPPO及mPPO活力受加熱溫度及時間的影響顯著，隨時間及溫度升高而快速失活。同時，表明碭山酥梨sPPO及mPPO的熱失活遵循一級反應動力學規律。

圖7 碭山酥梨mPPO熱穩定性（a）及失活速率（b）曲線Fig.7 Thermal stability (a) and thermal inactivation rate (b) of mPPO from Dangshan pear fruit

2.7 熱失活動力學比較

圖6（b）、圖7（b）中線性回歸的斜率即為熱失活速率常數的相反數（-k）。在熱失活動力學研究中，熱失活速率常數（k）、失活半衰期（t1/2）和失活活化能（Ea）是表征酶熱穩定性的三個重要參數。不同溫度下的失活速率k和半衰期t1/2反映酶失活快慢。由表2可知，sPPO及mPPO的失活速率常數k均隨著加熱溫度升高而增大，表明溫度越高sPPO及mPPO失活速率越快。45～65 ℃區間內sPPO的失活速率常數k比mPPO小，表明其失活速率低于mPPO。而75 ℃時，sPPO失活速率常數k比mPPO大，表明在75 ℃高溫時，sPPO失活速率高于mPPO。

表2 碭山酥梨mPPO及sPPO失活的一級動力學模型參數Table 2 Parameters of first-order kinetic model for Dangshan pear mPPO and sPPO inactivation

酶失活半衰期t1/2和D值也是表征酶熱失活速率的重要參數，sPPO及mPPO的半衰期t1/2和D值均隨著加熱溫度升高而減小，表明溫度越高，sPPO及mPPO失活速率越快。75 ℃時，sPPO半衰期t1/2和D值均比mPPO小，說明在此溫度下mPPO失活速率低于sPPO。這可能與其生理生化功能相關。Iyido?an等[25]在Amasya蘋果中發現了三個在80 ℃下具有高穩定性的PPO亞型。前期研究發現蘋果mPPO序列中有與熱激蛋白類似片段[13]，具體作用及機制有待于進一步研究。熱失活活化能Ea反映酶熱穩定性強弱，在同樣的處理條件下，Ea值越高表示反應對溫度的依賴性越大。ZT值是表征酶對溫度鈍化敏感性的指標，ZT值越大，說明該酶對溫度的耐受性越大。從表2可知，mPPO的Ea值為78.257 kJ·mol-1，sPPO的Ea值為106.560 kJ·mol-1，說明sPPO活性對溫度的依賴性更大。mPPO鈍化的ZT值為27.933 ℃，sPPO的ZT值為20.408 ℃，表明mPPO的熱耐受性更高。

3 結論

碭山酥梨mPPO與sPPO酶促性質差異明顯。以鄰苯二酚為底物時，mPPO對底物親和力比sPPO強，最易發生褐變。碭山酥梨mPPO酸堿穩定性好于sPPO。mPPO在pH3.50～4.50殘余酶活大于100%，其中在pH4.50時，殘余酶活為原來酶活的375.40%。mPPO最適反應溫度為35～45 ℃，且在高溫區間熱穩定性高于sPPO，且75 ℃處理10 min后mPPO活性顯著上升（P＜0.05）。熱失活動力學分析表明，相同溫度下mPPO更易發生酶促反應，且其熱耐受性更高。實驗發現，mPPO與sPPO酶促產物相比，mPPO酶促產物不易發生交聯，呈淺黃色，而不會出現sPPO酶促產物的棕褐色，這也從側面表明mPPO不是褐變的主要形式，它主要參與果蔬采后及加工中生理防御，比如貯藏期及鮮切貨架期內的抗逆性，這將是后期研究重點。