泡桐花多糖的體內(nèi)外抗氧化活性

陳曉蘭，圣志存，陳海峰，賈紀(jì)萍，李 冉，雒 丹，陳 未，冒玉娟

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300）

泡桐（Paulownia fortunei），又名白花泡桐、大果泡桐，空桐木等，隸屬玄參科（Scrophulariaceae）泡桐屬（Paulownia），屬于落葉喬木，廣泛分布我國(guó)各地，其藥用價(jià)值從古代就有記載[1]，且葉、花、果實(shí)均可作藥用，民間常煎煮用于治療肺熱咳嗽、癤腫、瘡癬等病證。泡桐花，泡桐植物常作藥用部位之一，春季花開時(shí)采收，曬干或鮮用?，F(xiàn)代醫(yī)藥研究表明，泡桐花含有豐富的多糖、黃酮、生物堿、皂苷、有機(jī)酸、揮發(fā)油、酚類及鞣質(zhì)類成分等有益人體的生物活性物質(zhì)[2]，具有抗炎[3]、抑菌[4]、調(diào)節(jié)免疫[5]等作用。當(dāng)前，關(guān)于泡桐花的營(yíng)養(yǎng)藥用價(jià)值，國(guó)內(nèi)外眾多研究者做了相關(guān)深入研究，但大多集中于泡桐花的化學(xué)或營(yíng)養(yǎng)成分[4,6-7]、黃酮的提取工藝[8]或含量測(cè)定[9]；而有關(guān)生物活性方面，免疫活性方面研究則較多[6,10-11]，鮮見有關(guān)泡桐花多糖及其抗氧化活性方面的研究報(bào)道。

多糖是多羥基醛和多羥基酮通過糖苷鍵連接的高分子聚合物,具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等諸多有益生理活性，是功能食品基料的主要來源之一[12]。因此有必要對(duì)泡桐花多糖體外、體內(nèi)的抗氧化功能進(jìn)行全面系統(tǒng)研究。

本研究以泡桐花多糖為研究對(duì)象，通過超氧陰離子、羥自由基清除能力以及抗H2O2氧化溶血率測(cè)定評(píng)價(jià)體外抗氧化活性。以小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，通過體內(nèi)抗氧化活性試驗(yàn)，測(cè)定泡桐花多糖對(duì)小鼠血清及心、肝、腎、回腸組織器官的SOD、GSH、MDA含量以及T-AOC水平的影響，以期為泡桐花資源深層探索提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

泡桐花 揚(yáng)中牧樂藥業(yè)有限公司提供；鄰苯三酚（AR）、鄰二氮菲（AR） 北京索萊寶科技有限公司；Vc（AR，≥99%）、硫酸亞鐵（AR） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SOD、GSH、T-AOC、MDA ELISA試劑盒 合肥萊爾生物科技有限公司；ICR小鼠（體重18～22 g） 揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2012-0004。

T-500B高速多功能粉碎機(jī) 永康市哈瑞工貿(mào)有限公司；BSA223S-CW電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；UV-2400紫外可見分光光度計(jì) 北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司；Anthos 2010酶標(biāo)儀 上海鼎謙生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外抗氧化試驗(yàn)

1.2.1.1 泡桐花多糖的提取與溶液制備 曬干泡桐花，機(jī)械粉碎過60目標(biāo)準(zhǔn)篩。取適量粉末樣品，按料液比1:30（g/mL），70 ℃水浴提取2 h。反應(yīng)結(jié)束，過濾去渣，濾液真空減壓濃縮之反應(yīng)前體積的十分之一，加入3倍體積的95%乙醇，醇沉過夜，離心得沉淀，即為粗多糖[13]。沉淀蒸餾水復(fù)溶，苯酚硫酸法[14]測(cè)定多糖含量（≥70%），稀釋配制成0.5、1.0、2.0 mg/mL的多糖溶液，待測(cè)。

1.2.1.2 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定 超氧陰離子自由基清除測(cè)定采用鄰苯三酚自氧化法[15]。

1.2.1.3 羥基自由基清除能力測(cè)定 羥基自由基清除測(cè)定采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[16]。

1.2.1.4 抗H2O2氧化溶血率測(cè)定 ICR小鼠眼球采血，肝素抗凝，4 ℃，3000 r/min離心，收集紅細(xì)胞，生理鹽水洗滌3次，制成0.5%紅細(xì)胞懸浮液。取試管48支，分為泡桐花多糖樣品組、空白組和本底對(duì)照組以及Vc對(duì)照組。取0.5%紅細(xì)胞懸液4.0 mL，依次加入不同濃度泡桐花多糖4.0 mL，50 mmol/LH2O22.0 mL，混勻，37 ℃水浴反應(yīng)1 h，加生理鹽水16 mL，3000 r/min離心5 min，取上清液紫外分光光度計(jì)測(cè)定415 nm處吸光度值，計(jì)算氧化溶血抑制率。

氧化溶血抑制率 = [A0- (A1- A2)] /A0× 100

式中：A0表示空白對(duì)照組吸光度（生理鹽水代替泡桐花提取液），A1表示樣品組吸光度；A2表示樣品本底吸光度（蒸餾水代替紅細(xì)胞懸浮液）。

1.2.2 體內(nèi)抗氧化試驗(yàn) 將50只ICR小鼠預(yù)飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分成5組，即空白對(duì)照（BC）組、泡桐花多糖低（PFFP-L）、中（PFFP-M）、高劑量（PFFP-H）組、Vc對(duì)照組，每組10只，雌雄分開飼養(yǎng)。其中，泡桐花多糖組小鼠低、中、高劑量依據(jù)前期免疫預(yù)實(shí)驗(yàn)，控制每天灌胃劑量分別為5、10、20 mg/mL泡桐花多糖溶液0.2 mL，等量體積蒸餾水、Vc（1 mg/mL）分別作為空白和陽性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠自由攝食和飲水，灌胃30 d后，禁食12 h，眼球采血，立即37 ℃靜置 2 h，4 ℃過夜，于4 ℃，3000 r/min離心10 min，分離血清，待測(cè)。采血后的小鼠處死解剖，取出心、肝、腎、回腸于預(yù)冷的生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙吸干表面水分，各組織器官與生理鹽水按1:9的比例低溫勻漿，制備勻漿液，3000 r/min 離心10 min，留上清液，待測(cè)。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定 a.體重變化：分別于給藥后的0、7、14、21和28 d稱重，稱重前禁食12 h。比較各組體重的變化。b.抗氧化活性測(cè)定：以各組小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟、回腸為試驗(yàn)樣品，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行SOD、GSH、MDA含量以及T-AOC指標(biāo)測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測(cè)定結(jié)果均重復(fù)3次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用SPSS 21.0 ANOVA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，Duncan法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 體外抗氧化試驗(yàn)

不同濃度泡桐花多糖溶液體外抗氧化指標(biāo)測(cè)定如表1所示。由表1可知，不同劑量的泡桐花多糖溶液對(duì)超氧陰離子、羥基自由基清除率以及抗H2O2氧化溶血率指標(biāo)均呈劑量依賴型。泡桐花多糖濃度為0.5 mg/mL時(shí)，超氧陰離子、羥基自由基清除率分別為54.36%、74.62%，均大于半數(shù)效應(yīng)50%；多糖濃度為1 mg/mL時(shí)，羥基自由基清除率超過Vc對(duì)照組（1 mg/mL）；多糖濃度為2 mg/mL時(shí)，抗H2O2氧化溶血率超過陽性對(duì)照組Vc（1 mg/mL）。自由基學(xué)說認(rèn)為生物體的衰老和各種疾病的過程是機(jī)體的組織細(xì)胞不斷產(chǎn)生的自由基積累結(jié)果，自由基可以引起細(xì)胞中的多種物質(zhì)發(fā)生氧化，損害生物膜，還能夠使蛋白質(zhì)、核酸等大分子交聯(lián)，影響其正常功能[17]。目前已經(jīng)證實(shí)，清除多余自由基的能力是機(jī)體內(nèi)本身所具備的，正常情況下，人體內(nèi)存在過氧化氫酶（CAT）、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等一些抗氧化酶類和抗氧化劑，使自由基的生成和清除處于動(dòng)態(tài)平衡[18-19]；但人體隨著年齡的增長(zhǎng)或處于高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)等不利環(huán)境條件時(shí)，會(huì)引起過多的自由基生成，從而導(dǎo)致自由基形成與消除失衡，使機(jī)體組織受損[20]。研究表明，適當(dāng)補(bǔ)充抗氧化劑可以減緩自由基氧化機(jī)體帶來的危害，因此, 尋找有效清除自由基的抗氧化食藥資源對(duì)人類健康具有重要意義。泡桐花多糖部分體外抗氧化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果與Vc相當(dāng)，可能預(yù)示泡桐花多糖是一種極具價(jià)值的亟待開發(fā)天然抗氧化劑，值得進(jìn)一步探索利用。

表1 泡桐花多糖體外抗氧化指標(biāo)測(cè)定Table 1 Determination of antioxidant indexs in vitro of Paulownia fortune flower polysaccharide

2.2 體內(nèi)抗氧化試驗(yàn)

2.2.1 泡桐花多糖對(duì)小鼠體重的影響 因雌雄小鼠體重和生長(zhǎng)速度有差異，因此雌雄小鼠進(jìn)行分開統(tǒng)計(jì)。泡桐花多糖對(duì)小鼠體重的影響結(jié)果如表2、表3所示。結(jié)果表明，雌雄小鼠給藥前及給藥后的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各給藥組之間小鼠體重均無顯著性差異（P＞0.05），因此認(rèn)為泡桐花多糖樣品對(duì)小鼠體質(zhì)量無影響。

表2 泡桐花多糖對(duì)雌性小鼠體重的影響（n=5）Table 2 Effect of Paulownia fortune flower polysaccharide on the weights of female mice (n=5)

表3 泡桐花多糖對(duì)雄性小鼠體重的影響（n=5）Table 3 Effect of Paulownia fortune flower polysaccharide on the weights of male mice (n=5)

2.2.2 泡桐花多糖對(duì)小鼠血清和組織器官中SOD的影響 SOD是需氧生物體內(nèi)上千種酶中唯一以氧自由基為底物的酶，對(duì)底物有絕對(duì)的專一性，它能催化H+和O2相結(jié)合生成H2O2，因而SOD含量水平的高低可作為機(jī)體評(píng)價(jià)抗氧化能力的標(biāo)志[21-22]。如圖1所示，與空白組對(duì)比可知，泡桐花多糖中、高劑量組能顯著增加血清SOD含量（P＜0.05），分別增加了226.63%、149.07%，且中、高劑量酶含量接近Vc；低劑量則與空白組無顯著差異（P＞0.05）且顯著低于Vc對(duì)照組（P＜0.05）。組織器官SOD含量，與空白組對(duì)比，泡桐花多糖低劑量組SOD含量普遍略高于空白組，但僅心臟有顯著差異（P＜0.05）。中、高劑量組心臟、回腸組織器官含量均顯著增加（P＜0.05）；中劑量組分別增加了42.38%、68.32%；高劑量組分別增加了99.05%、83.59%（P＜0.05）；肝臟、腎臟含量則差異變化不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 泡桐花多糖對(duì)小鼠血清和組織器官GSH的影響GSH是機(jī)體內(nèi)最重要的非酶性過氧化物，可以保護(hù)細(xì)胞中蛋白質(zhì)分子的巰基（-SH）免遭氧化，同時(shí)具有清除活性氧、H2O2、LOOH等自由基作用，因而GSH量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素[23-24]。如圖2所示，與空白組對(duì)比，泡桐花多糖低、中、高劑量組均能增加血清中GSH含量，且呈劑量依賴型，但均低于Vc對(duì)照組。組織器官GSH含量測(cè)定結(jié)果顯示，泡桐花多糖低、中、高劑量含量均高于空白組。與空白組相比，低劑量組肝臟、回腸GSH顯著（P＜0.05）增加，分別增加了60.03%、69.40%；中、高劑量組心臟、肝臟、回腸差異均顯著（P＜0.05），中劑量分別增加了55.31%、104.89%、70.43%；高劑量分別增加了110.62%、135.49%、163.52%，且高劑量組顯著高于Vc（P＜0.05）；所有劑量組腎臟中GSH量增加但不顯著（P＞0.05）。

圖2 泡桐花多糖對(duì)小鼠血清和組織器官GSH的影響（n=4）Fig.2 Effect of Paulownia fortune flower polysaccharide on GSH in the serum and tissues of mice (n=4)

2.2.4 泡桐花多糖對(duì)小鼠血清和組織器官M(fèi)DA的影響 MDA是由自由基與多不飽和脂肪酸反應(yīng)形成過氧自由基和過氧化脂質(zhì)，兩者代謝合成MDA，常用的膜脂過氧化指標(biāo)，因此，通過主要末端產(chǎn)物MDA的含量的檢測(cè)可以反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化和受損的程度[25-26]。如圖3所示，與空白組相比，泡桐花多糖血清低、中、高和Vc對(duì)照組均能顯著降低MDA含量（P＜0.05），分別降低了56.50%、61.73%、62.13%、65.12%。心臟組織所有劑量組MDA含量均顯著降低（P＜0.05）；其他組織器官實(shí)驗(yàn)組，僅有腎臟中、高劑量和回腸高劑量組顯著降低（P＜0.05），分別降低了33.73%、34.92%、25.80%。但同時(shí)發(fā)現(xiàn)，泡桐花多糖血清和所有臟器組織MDA含量并未隨給藥劑量的增加而呈劑量依賴顯著降低，各低、中、高劑量組間差異無顯著變化（P＞0.05）。

圖3 泡桐花多糖對(duì)小鼠血清和組織器官M(fèi)DA的影響（n=4）Fig.3 Effect of Paulownia fortune flower polysaccharide on MDA in the serum and tissues of mice (n=4)

圖4 泡桐花多糖對(duì)小鼠血清和組織器官T-AOC水平的影響（n=4）Fig.4 Effect of Paulownia fortune flower polysaccharide on T-AOC in the serum and tissues of mice (n=4)

2.2.5 泡桐花多糖對(duì)小鼠血清和組織器官中T-AOC的影響 機(jī)體的抗氧化防御途徑主要有消除自由基和活性氧、分解過氧化物、除去催化作用的金屬離子，包括酶促與非酶促兩個(gè)體系部分，兩者構(gòu)成總抗氧化水平[27-28]。酶促體系主要包括SOD、GSH-Px、CAT、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）等抗氧化酶[29]；非酶促反應(yīng)體系中主要為維生素、氨基酸和金屬蛋白質(zhì)[30]。如圖4所示，泡桐花多糖高、中劑量均能顯著增加血清和各個(gè)組織器官T-AOC水平（P＜0.05），且組織器官高于陽性對(duì)照組Vc；血清則高劑量效果與Vc相當(dāng)。與空白組相比，低劑量組僅肝臟、腎臟、回腸表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05），血清和心臟則不顯著（P＞0.05）。綜合而言，灌胃一定劑量的泡桐花多糖

樣品，小鼠血清和主要臟器的總抗氧化能力均能顯著增加，證實(shí)泡桐花多糖資源值得進(jìn)一步挖掘利用。

3 結(jié)論

對(duì)泡桐花水提醇沉多糖的體內(nèi)外抗氧化作用進(jìn)行了較為系統(tǒng)的評(píng)價(jià)。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，泡桐花多糖對(duì)超氧陰離子、羥基自由基、抗H2O2溶血率均有較為顯著的清除或抑制作用。多糖濃度為0.5 mg/mL時(shí)，泡桐花多糖對(duì)超氧陰離子、羥基自由基的清除率均超過半數(shù)效應(yīng)50%；1 mg/mL時(shí)，羥基自由基指標(biāo)結(jié)果強(qiáng)于陽性對(duì)照Vc；2 mg/mL時(shí)，泡桐花多糖抗H2O2溶血率超過陽性對(duì)照Vc（1 mg/mL）。體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，泡桐花多糖能夠提高小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟、回腸組織SOD和GSH含量、T-AOC水平和降低MDA含量，且呈一定的劑量依賴性，說明泡桐花多糖具有良好的體內(nèi)抗氧化作用，可作為新型天然抗氧化劑探索應(yīng)用于醫(yī)藥保健、功能食品等領(lǐng)域。