泡桐花多糖的體內外抗氧化活性

陳曉蘭，圣志存，陳海峰，賈紀萍，李 冉，雒 丹，陳 未，冒玉娟

（江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州 225300）

泡桐（Paulownia fortunei），又名白花泡桐、大果泡桐，空桐木等，隸屬玄參科（Scrophulariaceae）泡桐屬（Paulownia），屬于落葉喬木，廣泛分布我國各地，其藥用價值從古代就有記載[1]，且葉、花、果實均可作藥用，民間常煎煮用于治療肺熱咳嗽、癤腫、瘡癬等病證。泡桐花，泡桐植物常作藥用部位之一，春季花開時采收，曬干或鮮用。現代醫藥研究表明，泡桐花含有豐富的多糖、黃酮、生物堿、皂苷、有機酸、揮發油、酚類及鞣質類成分等有益人體的生物活性物質[2]，具有抗炎[3]、抑菌[4]、調節免疫[5]等作用。當前，關于泡桐花的營養藥用價值，國內外眾多研究者做了相關深入研究，但大多集中于泡桐花的化學或營養成分[4,6-7]、黃酮的提取工藝[8]或含量測定[9]；而有關生物活性方面，免疫活性方面研究則較多[6,10-11]，鮮見有關泡桐花多糖及其抗氧化活性方面的研究報道。

多糖是多羥基醛和多羥基酮通過糖苷鍵連接的高分子聚合物,具有抗氧化、調節免疫等諸多有益生理活性，是功能食品基料的主要來源之一[12]。因此有必要對泡桐花多糖體外、體內的抗氧化功能進行全面系統研究。

本研究以泡桐花多糖為研究對象，通過超氧陰離子、羥自由基清除能力以及抗H2O2氧化溶血率測定評價體外抗氧化活性。以小鼠為試驗動物，通過體內抗氧化活性試驗，測定泡桐花多糖對小鼠血清及心、肝、腎、回腸組織器官的SOD、GSH、MDA含量以及T-AOC水平的影響，以期為泡桐花資源深層探索提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

泡桐花 揚中牧樂藥業有限公司提供；鄰苯三酚（AR）、鄰二氮菲（AR） 北京索萊寶科技有限公司；Vc（AR，≥99%）、硫酸亞鐵（AR） 國藥集團化學試劑有限公司；SOD、GSH、T-AOC、MDA ELISA試劑盒 合肥萊爾生物科技有限公司；ICR小鼠（體重18～22 g） 揚州大學比較醫學中心，動物生產許可證號：SCXK（蘇）2012-0004。

T-500B高速多功能粉碎機 永康市哈瑞工貿有限公司；BSA223S-CW電子天平 德國賽多利斯公司；UV-2400紫外可見分光光度計 北京世紀科信科學儀器有限公司；Anthos 2010酶標儀 上海鼎謙生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 體外抗氧化試驗

1.2.1.1 泡桐花多糖的提取與溶液制備 曬干泡桐花，機械粉碎過60目標準篩。取適量粉末樣品，按料液比1:30（g/mL），70 ℃水浴提取2 h。反應結束，過濾去渣，濾液真空減壓濃縮之反應前體積的十分之一，加入3倍體積的95%乙醇，醇沉過夜，離心得沉淀，即為粗多糖[13]。沉淀蒸餾水復溶，苯酚硫酸法[14]測定多糖含量（≥70%），稀釋配制成0.5、1.0、2.0 mg/mL的多糖溶液，待測。

1.2.1.2 超氧陰離子自由基清除能力測定 超氧陰離子自由基清除測定采用鄰苯三酚自氧化法[15]。

1.2.1.3 羥基自由基清除能力測定 羥基自由基清除測定采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[16]。

1.2.1.4 抗H2O2氧化溶血率測定 ICR小鼠眼球采血，肝素抗凝，4 ℃，3000 r/min離心，收集紅細胞，生理鹽水洗滌3次，制成0.5%紅細胞懸浮液。取試管48支，分為泡桐花多糖樣品組、空白組和本底對照組以及Vc對照組。取0.5%紅細胞懸液4.0 mL，依次加入不同濃度泡桐花多糖4.0 mL，50 mmol/LH2O22.0 mL，混勻，37 ℃水浴反應1 h，加生理鹽水16 mL，3000 r/min離心5 min，取上清液紫外分光光度計測定415 nm處吸光度值，計算氧化溶血抑制率。

氧化溶血抑制率 = [A0- (A1- A2)] /A0× 100

式中：A0表示空白對照組吸光度（生理鹽水代替泡桐花提取液），A1表示樣品組吸光度；A2表示樣品本底吸光度（蒸餾水代替紅細胞懸浮液）。

1.2.2 體內抗氧化試驗 將50只ICR小鼠預飼養7 d后隨機分成5組，即空白對照（BC）組、泡桐花多糖低（PFFP-L）、中（PFFP-M）、高劑量（PFFP-H）組、Vc對照組，每組10只，雌雄分開飼養。其中，泡桐花多糖組小鼠低、中、高劑量依據前期免疫預實驗，控制每天灌胃劑量分別為5、10、20 mg/mL泡桐花多糖溶液0.2 mL，等量體積蒸餾水、Vc（1 mg/mL）分別作為空白和陽性對照。實驗期間，小鼠自由攝食和飲水，灌胃30 d后，禁食12 h，眼球采血，立即37 ℃靜置 2 h，4 ℃過夜，于4 ℃，3000 r/min離心10 min，分離血清，待測。采血后的小鼠處死解剖，取出心、肝、腎、回腸于預冷的生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙吸干表面水分，各組織器官與生理鹽水按1:9的比例低溫勻漿，制備勻漿液，3000 r/min 離心10 min，留上清液，待測。

1.2.3 指標測定 a.體重變化：分別于給藥后的0、7、14、21和28 d稱重，稱重前禁食12 h。比較各組體重的變化。b.抗氧化活性測定：以各組小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟、回腸為試驗樣品，嚴格按照試劑盒說明書進行SOD、GSH、MDA含量以及T-AOC指標測定。

1.3 數據處理

所有測定結果均重復3次，以平均值±標準差表示；采用SPSS 21.0 ANOVA對數據進行方差分析，Duncan法進行多重比較，以P＜0.05 表示有統計學差異。

2 結果與討論

2.1 體外抗氧化試驗

不同濃度泡桐花多糖溶液體外抗氧化指標測定如表1所示。由表1可知，不同劑量的泡桐花多糖溶液對超氧陰離子、羥基自由基清除率以及抗H2O2氧化溶血率指標均呈劑量依賴型。泡桐花多糖濃度為0.5 mg/mL時，超氧陰離子、羥基自由基清除率分別為54.36%、74.62%，均大于半數效應50%；多糖濃度為1 mg/mL時，羥基自由基清除率超過Vc對照組（1 mg/mL）；多糖濃度為2 mg/mL時，抗H2O2氧化溶血率超過陽性對照組Vc（1 mg/mL）。自由基學說認為生物體的衰老和各種疾病的過程是機體的組織細胞不斷產生的自由基積累結果，自由基可以引起細胞中的多種物質發生氧化，損害生物膜，還能夠使蛋白質、核酸等大分子交聯，影響其正常功能[17]。目前已經證實，清除多余自由基的能力是機體內本身所具備的，正常情況下，人體內存在過氧化氫酶（CAT）、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等一些抗氧化酶類和抗氧化劑，使自由基的生成和清除處于動態平衡[18-19]；但人體隨著年齡的增長或處于高負荷運動等不利環境條件時，會引起過多的自由基生成，從而導致自由基形成與消除失衡，使機體組織受損[20]。研究表明，適當補充抗氧化劑可以減緩自由基氧化機體帶來的危害，因此, 尋找有效清除自由基的抗氧化食藥資源對人類健康具有重要意義。泡桐花多糖部分體外抗氧化指標測定結果與Vc相當，可能預示泡桐花多糖是一種極具價值的亟待開發天然抗氧化劑，值得進一步探索利用。

表1 泡桐花多糖體外抗氧化指標測定Table 1 Determination of antioxidant indexs in vitro of Paulownia fortune flower polysaccharide

2.2 體內抗氧化試驗

2.2.1 泡桐花多糖對小鼠體重的影響 因雌雄小鼠體重和生長速度有差異，因此雌雄小鼠進行分開統計。泡桐花多糖對小鼠體重的影響結果如表2、表3所示。結果表明，雌雄小鼠給藥前及給藥后的4個時間點，各給藥組之間小鼠體重均無顯著性差異（P＞0.05），因此認為泡桐花多糖樣品對小鼠體質量無影響。

表2 泡桐花多糖對雌性小鼠體重的影響（n=5）Table 2 Effect of Paulownia fortune flower polysaccharide on the weights of female mice (n=5)

表3 泡桐花多糖對雄性小鼠體重的影響（n=5）Table 3 Effect of Paulownia fortune flower polysaccharide on the weights of male mice (n=5)

2.2.2 泡桐花多糖對小鼠血清和組織器官中SOD的影響 SOD是需氧生物體內上千種酶中唯一以氧自由基為底物的酶，對底物有絕對的專一性，它能催化H+和O2相結合生成H2O2，因而SOD含量水平的高低可作為機體評價抗氧化能力的標志[21-22]。如圖1所示，與空白組對比可知，泡桐花多糖中、高劑量組能顯著增加血清SOD含量（P＜0.05），分別增加了226.63%、149.07%，且中、高劑量酶含量接近Vc；低劑量則與空白組無顯著差異（P＞0.05）且顯著低于Vc對照組（P＜0.05）。組織器官SOD含量，與空白組對比，泡桐花多糖低劑量組SOD含量普遍略高于空白組，但僅心臟有顯著差異（P＜0.05）。中、高劑量組心臟、回腸組織器官含量均顯著增加（P＜0.05）；中劑量組分別增加了42.38%、68.32%；高劑量組分別增加了99.05%、83.59%（P＜0.05）；肝臟、腎臟含量則差異變化不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 泡桐花多糖對小鼠血清和組織器官GSH的影響GSH是機體內最重要的非酶性過氧化物，可以保護細胞中蛋白質分子的巰基（-SH）免遭氧化，同時具有清除活性氧、H2O2、LOOH等自由基作用，因而GSH量的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素[23-24]。如圖2所示，與空白組對比，泡桐花多糖低、中、高劑量組均能增加血清中GSH含量，且呈劑量依賴型，但均低于Vc對照組。組織器官GSH含量測定結果顯示，泡桐花多糖低、中、高劑量含量均高于空白組。與空白組相比，低劑量組肝臟、回腸GSH顯著（P＜0.05）增加，分別增加了60.03%、69.40%；中、高劑量組心臟、肝臟、回腸差異均顯著（P＜0.05），中劑量分別增加了55.31%、104.89%、70.43%；高劑量分別增加了110.62%、135.49%、163.52%，且高劑量組顯著高于Vc（P＜0.05）；所有劑量組腎臟中GSH量增加但不顯著（P＞0.05）。

圖2 泡桐花多糖對小鼠血清和組織器官GSH的影響（n=4）Fig.2 Effect of Paulownia fortune flower polysaccharide on GSH in the serum and tissues of mice (n=4)

2.2.4 泡桐花多糖對小鼠血清和組織器官MDA的影響 MDA是由自由基與多不飽和脂肪酸反應形成過氧自由基和過氧化脂質，兩者代謝合成MDA，常用的膜脂過氧化指標，因此，通過主要末端產物MDA的含量的檢測可以反映機體脂質過氧化和受損的程度[25-26]。如圖3所示，與空白組相比，泡桐花多糖血清低、中、高和Vc對照組均能顯著降低MDA含量（P＜0.05），分別降低了56.50%、61.73%、62.13%、65.12%。心臟組織所有劑量組MDA含量均顯著降低（P＜0.05）；其他組織器官實驗組，僅有腎臟中、高劑量和回腸高劑量組顯著降低（P＜0.05），分別降低了33.73%、34.92%、25.80%。但同時發現，泡桐花多糖血清和所有臟器組織MDA含量并未隨給藥劑量的增加而呈劑量依賴顯著降低，各低、中、高劑量組間差異無顯著變化（P＞0.05）。

圖3 泡桐花多糖對小鼠血清和組織器官MDA的影響（n=4）Fig.3 Effect of Paulownia fortune flower polysaccharide on MDA in the serum and tissues of mice (n=4)

圖4 泡桐花多糖對小鼠血清和組織器官T-AOC水平的影響（n=4）Fig.4 Effect of Paulownia fortune flower polysaccharide on T-AOC in the serum and tissues of mice (n=4)

2.2.5 泡桐花多糖對小鼠血清和組織器官中T-AOC的影響 機體的抗氧化防御途徑主要有消除自由基和活性氧、分解過氧化物、除去催化作用的金屬離子，包括酶促與非酶促兩個體系部分，兩者構成總抗氧化水平[27-28]。酶促體系主要包括SOD、GSH-Px、CAT、谷胱甘肽S-轉移酶（GST）等抗氧化酶[29]；非酶促反應體系中主要為維生素、氨基酸和金屬蛋白質[30]。如圖4所示，泡桐花多糖高、中劑量均能顯著增加血清和各個組織器官T-AOC水平（P＜0.05），且組織器官高于陽性對照組Vc；血清則高劑量效果與Vc相當。與空白組相比，低劑量組僅肝臟、腎臟、回腸表現差異顯著（P＜0.05），血清和心臟則不顯著（P＞0.05）。綜合而言，灌胃一定劑量的泡桐花多糖

樣品，小鼠血清和主要臟器的總抗氧化能力均能顯著增加，證實泡桐花多糖資源值得進一步挖掘利用。

3 結論

對泡桐花水提醇沉多糖的體內外抗氧化作用進行了較為系統的評價。體外抗氧化實驗結果表明，泡桐花多糖對超氧陰離子、羥基自由基、抗H2O2溶血率均有較為顯著的清除或抑制作用。多糖濃度為0.5 mg/mL時，泡桐花多糖對超氧陰離子、羥基自由基的清除率均超過半數效應50%；1 mg/mL時，羥基自由基指標結果強于陽性對照Vc；2 mg/mL時，泡桐花多糖抗H2O2溶血率超過陽性對照Vc（1 mg/mL）。體內抗氧化實驗表明，泡桐花多糖能夠提高小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟、回腸組織SOD和GSH含量、T-AOC水平和降低MDA含量，且呈一定的劑量依賴性，說明泡桐花多糖具有良好的體內抗氧化作用，可作為新型天然抗氧化劑探索應用于醫藥保健、功能食品等領域。