35味中草藥提取物體外抑菌活性的研究

高 語

喀什大學生命與地理科學學院，新疆 喀什 844000

地理區位、生態條件獨特的新疆維吾爾自治區，蘊藏著豐富、上好的中藥材資源[1]。南疆四地州(阿克蘇地區、喀什地區、和田地區與克孜勒蘇柯爾克孜自治州)冬季溫和、日照充足、外貿潛力深厚[2]。近些年來，中草藥種植業逐漸成為當地農戶增收致富的新途徑，展現出良好的經濟、社會效益，前景廣闊。其中已經達到了一定的種植規模、具有地理標志性的中藥材有：和田玫瑰、岳普湖孜然、阿克蘇甘草、烏什沙棘、克州紅花與葉城紫草。帶動南疆地區中草藥種植業的優質、長效發展，需要解決產業鏈短、附加值低等一系列市場難題。現今，維吾爾民族醫藥尚缺乏經現代化、規范化研發生產的特色新藥品種[3]。新疆深居內陸、氣候干燥、人口集中，而抗菌素易積累于稀缺的水資源中[4]，故“減抗”、“替抗”刻不容緩、勢在必行。研究中草藥材的體外抑菌活性，可以在一定程度上幫助疾病防治、新藥開發、環境保護與產業規劃。

發達的物流加速了優質藥材的流動，為民族藥劑創新搭建了嶄新的平臺。全國各族人民在長期實踐中發掘的本草、方藥[6]，擴展了維吾爾醫藥的科研視野。表1中列出的35味載于《中華本草》、《維吾爾藥志》的藥材[7-8]。它們或清熱解毒，或化痰止咳，或消腫排膿，或祛風解表，或理血固澀，常被用于抗炎、殺菌[9]，且療效確切、基源可靠。

表1 35種供試草藥

表2中列出的14種標準指示菌在有氧環境中生長良好。其中的革蘭氏陽性(G+)球菌S.a、S.p，革蘭氏陰性(G-)腸桿菌K.p、E.c與G-非發酵菌P.a、A.b，是臨床感染與傳播中最常檢出的病原菌[10]。L.m、S.t、S.f常見于食源性人畜共患疾病。P.m、S.m、A.f廣泛分布于水與土壤中，是重要的條件致病菌。B.s具有典型的芽孢桿菌特征。C.a是常見于頑固的皮膚黏膜感染的真菌。

表2 14種指示菌株

中草藥體外抑菌活性是中醫研究的經典課題。早在1947年，徐振氏[11]就進行了400種中草藥對4種病原菌的體外抑菌實驗。據筆者于2020年10月的查詢，中國知網收錄的標題中含“中藥”與“體外抑菌”的文獻已達2651篇。微量增效劑即可大幅提高主方藥物的抑菌活性。然而，礙于“試管法”與藥敏紙片法程序繁瑣，前人的工作大多停留在單方藥層次，少見關于藥物間增效抑菌的研究。96孔板微量肉湯稀釋法操作簡便、功能多樣、結果可靠。采用此方法，筆者測定35種中草藥提取物與10種抗菌素對14種標準指示菌株的MIC90；并在此基礎上，進一步測定了10種中草藥提取物經超濾離心分離得到的大、小分子的MIC90；篩選出可增效抑菌的藥物組合。

1 儀器與材料

1.1 指示菌 K.p、P.a、A.b、S.a、E.c由深圳市呼吸疾病研究所提供，10%甘油凍藏于離心管內。C.a、L.m、B.s、S.p、S.t、P.m、A.f、S.m、S.f購于廣東環凱微生物生物技術有限公司，為凍干粉。

1.2 抗菌素 紅霉素(ERY)、四環素(TCY)、頭孢他啶(CFZ)、卡那霉素(KAN)、萬古霉素(VAN)、氯霉素(CHL)、青霉素(PEN)、氧氟沙星(OFX)、多粘菌素B(PB)、美羅培南(MEM)由深圳市呼吸疾病研究所提供。

1.3 中草藥 野生人字草、千葉蓍采自喀什市英吾斯坦鄉，沙棘、玫瑰、紫草、孜然、甘草、紅花為人工栽植品。以上藥材經超聲清洗后，于干燥箱內烘干。秦艽、伊貝母、洋甘菊、雪蓮本草購自新疆伊鼎輝煌生物科技有限公司，為干品。木香、胡黃連30∶1(料液比)提取物購自陜西橫嶺生物科技有限公司。其余20∶1提取物購自西安金綠生物工程技術有限公司。以上直接購得的提取物均由大宗正品本草經三次75%乙醇提取而成，干粉收率為8%±2%。所有藥材標本均保存于喀什大學生命與地理科學學院植物標本室中，經顯微形態學鑒定均符合2020年版《中國藥典》與以往文獻報道中的相關描述。

1.4 試劑 磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、噻唑藍(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT，生工生物工程，批號：F411BA0017)；龍膽苦苷(成都植標化純生物技術有限公司)；雙蒸水(粵戴水處理設備有限公司)；

1.5 培養基 陽離子調節MH肉湯(Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth,CAMHB)，pH 7.2，大連美侖生物，批號:MB2439-Jul-11D)。LB平板(常德比克曼生物科技有限公司)。

1.6 儀器 IX53倒置顯微鏡(Olympus)；高壓蒸汽滅菌器(PHCbi)；KH3200DE型超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器)；XA-1型多功能粉碎機(江蘇姜堰市分析儀器廠)；ZK-82B真空干燥箱(上海市實驗儀器總廠)；RE100-Pro旋轉蒸發儀(Scilogex)；HR40-IIA2型生物安全柜(青島海爾)；Bluepard THZ-100B恒溫培養搖床、Bluepard DHP-9031微生物培養箱(上海一恒)；Centrifuge 5810R大容量離心機、AG22331 Hamburg紫外可見光分光光度計(Eppendorf)；iMark酶標儀(Bio-Rad)；JJ224BC型電子天平(G&G)；PHS-3C酸度計(成都銳新)；075870麥氏比濁管(廣東環凱)；5mL截留分子量3kDa超濾離心管(PALL)；各量程單道、八道移液器(RAININ)；

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 提取 將干燥、粉碎、過篩(40目，孔徑0.37 mm)的藥材粉末稱取16 g，置于無紡布袋內，300 mL 60%乙醇70 ℃水浴浸泡2 h。20 kHz超聲提取40 min。抽濾除渣。12000 rpm離心3 min。棄沉淀。減壓濃縮上清液至稍有固體粉末析出。用雙蒸水溶解至10 mL。購得的提取物粉末取1.28 g溶于10 mL雙蒸水中。得到生藥當量濃度1600 mg/mL的藥液。搖勻。加入10 mL 2×CAMHB。得到800 mg/mL藥液。測定pH值。配置與35種藥液中最低pH值等同的CAMHB培養基(沙棘，pH 3.76)用于陽性對照。800 mg/mL藥液用0.22 um微孔濾膜濾過除菌。置于4℃冰箱備用。

2.1.2 菌株 菌株經復蘇、復壯后，于CAMHB中37 ℃ 120 r/min振蕩培養至對數生長期(OD6000.6～0.8)。菌液調節至0.5麥氏單位濁度(OD6250.08～0.13)后，2∶3稀釋，使其中含菌1×108cfu/mL。

2.1.3 微量肉湯稀釋法測MIC90遵照ISO 20776-1[12]、CLSI M07-A10[13]與M27-S4[14]中關于肉湯微量稀釋法的操作規范，在96孔微量稀釋板中，一列一藥，A孔加入各800 mg/mL藥液200 μL；B-G孔內加入100 μL CAMHB；A孔吸取100 μL，依次倍比稀釋至G孔，棄余液100 μL。使A-G生藥當量濃度 (Crude drug equivalent concentration)ck(k=1、2…7)分別為800、400、200、100、50、25、12.5 mg/mL。由于高濃度中藥液呈深色，需要在H孔內各加入800 mg/mL藥液100 μL作陰性“藥液對照”。留未接菌板作“初始對照”。抗菌素藥敏試驗無需陰性對照。A-H孔抗菌素濃度梯度ck(k=1、2…8)為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL。如圖1所示。

一板一菌。實驗組各孔接1 μL 1×108CFU/mL菌液；使其中最終接菌量為1×106CFU/mL。第12列A-D孔加入100 μL CAMHB作空白“肉湯對照”。E-H加入100 μL酸性對照培養基，并同上接菌1 μL，作陽性“生長對照”。加蓋，37 ℃恒溫培養18 h。MTT可被活菌線粒體中的琥珀酸脫氫酶氧化為藍紫色結晶。96孔內均加入20 μL 5 mg/mL的MTT PBS溶液(初始對照同)。37 ℃避光30 min。測定OD600。

2.1.4 超濾分離 取4 mL 800 mg/mL藥液于3 kDa超濾管中離心至完全分離，得到含大、小分子成分的兩組子藥液。高溫高壓滅菌后，子藥液分別重復前述步驟，測定MIC90。

2.1.5 數據處理方法 各行A-G、H格抑菌率Ik(k=1、2…7、8)(%)=1-[Ok-(On/Osn)×Osk]/(Op-Ob)×100%。Ok：第k孔中的OD值；On：陰性對照孔OD值；Osn：初始對照該列陰性對照OD值；Op：陽性對照孔平均OD值；Ob：空白對照孔平均OD值；Osk：該列初始對照第k孔OD值；滿足In(n∈k)>90%的最低cn記為MIC90。2.1.3、2.1.4中每列藥-菌試驗重復7次，得離散MIC90數列mp(p=1、2…7)。取mp中的眾數記錄。

2.1.6 抗菌增效藥物組合的篩選 ①制備“增效劑庫”。取一96孔板，1-5、7-11列前35孔依藥材編號次序加入200 μL 800mg/mL的中藥液，5、11兩列后5孔加入10種200 μL 16 μg/mL抗菌素，6、12列加入200 μL CAMHB。 ②制備“實驗板”。“增效劑庫”各孔取2 μL對應加入空白96孔板后，在第該板1-5、7-11列加入98 μL 1/2 MIC90主方的接菌肉湯(空白對照加入等量無菌無藥CAMHB肉湯)，6、12列加入98 μL CAMHB。“實驗板”加蓋，37 ℃培養18 h后，加入MTT。判定清亮孔中的藥物組合增效抑菌作用為顯著。

2.1.7 棋盤法藥物聯用將兩種抗菌藥物倍比稀釋為8個濃度梯度。按A-G、8-1濃度遞減順序，各取50 μL兩兩組合加入96孔平板中，得到每孔100 μL的8×8棋盤矩陣。遵照2.1.3中的方案，9、10列照作兩種藥物的MIC實驗；剩余孔作陰性、陽性、空白對照。留未接菌板作初始對照。

2.2 結果

2.2.1 中草藥提取物對標準指示菌株實驗中所有空白、陰性對照孔均清亮，陽性對照孔呈深藍紫色； CLSI M100[15]中涉及到的標準株均為敏感；實驗處于正常狀態。由表3、4可知，玫瑰對于除C.a外的13種指示菌，秦艽對B.s、E.c、S.f、K.p、A.b，沙棘對P.a，千葉蓍對S.p、K.p和A.b，胡黃連對S.a和A.b，駱駝篷子與紅花對E.c，人字草、巖白菜與甘草對S.a，駱駝蓬子與甘草對S.p，薄荷對S.a、P.a，具有較強的抑菌作用。甘草對G+細菌的抑菌活性高于G-細菌。只有紫草、薄荷可以抑制C.a。

表3 10種抗菌素對14種標準指示菌株的MIC90 (μg/mL)

表4 35種中草藥提取物對14種標準指示菌株的的MIC90

2.2.2 10種中草藥提取液經篩分后成分的結果 選取云南產胡黃連，西藏產巖白菜，新疆產秦艽、沙棘、千葉蓍、人字草、玫瑰、駱駝蓬子、紅花、甘草10種中草藥液超濾分離。因各子藥液體積均不低于原藥液的1/3，其生藥當量濃度記為800 mg/mL。由表5可知，千葉蓍抗S.p時的活性的物質為3000 Da以下小分子，抗S.t時大、小分子的MIC90等同于未經超濾離心分離的原藥液。沙棘在抗P.a、E.c時，大、小分子的MIC90也與原藥液相同。秦艽、胡黃連、人字草在抑制S.a等菌時的活性物質為3000Da以上大分子。以龍膽苦苷為代表的裂環環烯醚萜類常被認為是秦艽的特征成分。本實驗證實，4 mg/mL的龍膽苦苷對E.c、A.b無抑菌活性。玫瑰(圖2.1)、駱駝蓬子、紅花、甘草的大、小分子普遍具有協同抑菌作用。人字草的小分子雖然無法直接抑制S.a，但是可以增強其大分子的抑菌能力(圖2.2)。巖白菜提取物中的大、小分子在抑制S.a、P.a、E.c時有協同作用，而在抑制A.b時，則大、小分子拮抗。這表明，中草藥抑菌是多靶點的。針對不同的菌株，中草藥成分的藥效作用機制不同。

表5 10種中草藥提取液經3 kDa超濾離心管篩分后成分的MIC90

2.2.3 抗菌增效藥物組合 秦艽、柴胡、甘草是常用于治療發熱與上呼吸道感染的復方搭配。秦艽可顯著增效頭孢他啶對大腸埃希菌的抑菌活性(圖2.3)；50%抑菌折點為CFZ 0.125 μg/mL、秦艽12.5 mg/mL。CFZ抑制轉肽酶在細菌細胞壁形成過程中的轉肽作用。牛俊瑞[30]的研究指出，破壞生物膜可有效抑制E.c，且只有當頭孢他啶與黃芩等中藥提取物的濃度均達到一定閾值時，聯合用藥才可有效抑菌。此結果與本實驗圖2.3中明顯的橫、縱分界線吻合，提示秦艽增效CFZ的抑菌機制可能與破壞E.c的生物膜相關。黏肽合成酶PBP1b是亞-MIC CFZ抑制E.c生物膜形成的主要靶點[31]。童麗艷[32]使用計算機輔助分子對接技術，從104萬個化合物中篩選出的4種作用于PBP1b的先導化合物，均具有苯磺酸基團結構，分子量在275～425 Da之間，對E.c、L.m、B.s、S.a、P.a的MIC為175～225 μg/mL。然而，龍膽科植物化學成分中未見此類化合物的報導。秦艽中增效CFZ的化學成分，有待進一步發掘研究。

沙棘可增效CHL、OFX抑制銅綠假單胞菌；50%抑菌折點分別為CHL 8 μg/mL、沙棘6.25 mg/mL與OFX 1 μg/mL、沙棘25 mg/mL。銅綠假單胞菌在呼吸系統感染中最為常見，是呼吸機相關性肺炎的重要病原菌。在沙棘濃度為25 mg/mL時，CHL對P.a的90%最小抑菌濃度可由單用時的16 μg/mL降低至4 μg/mL。CHL通過干擾tRNA結合在在細菌70S核糖體50S亞基上，抑制蛋白質合成。OFX抑制細菌DNA旋轉酶的活性而阻止細菌DNA的合成和復制。戴曉天[33]發現，酸性環境抑制P.a的生長與生物膜的生成，并降低P.a蛋白水解酶的分泌；OFX抑制P.a活性隨Ph的增高而降低。于是，筆者將沙棘藥液Ph調節至7.2再次測試，發現其對OFX的增效作用略微減弱，而對CHL的增效作用無變化(圖2.4)。見表6。

表6 抗菌增效藥物組合

千葉蓍耐脊薄、干旱，易于栽培，與薄荷、獨活、柴胡等多種藥物聯用時可以有效抑制P.a與A.b。而現今，千葉蓍在南疆地區仍然鮮有栽植。

3 討論

抗菌素的廣泛使用，在有效地控制細菌感染的同時，造成了不同程的殘留和耐藥性后果。中藥以其毒副作用小、無殘留、不易產生抗藥性等諸多優勢，愈加受到科研工作者的重視。各地中藥材的研究，都為民族醫藥的現代化研發提供了參照。據報導，鞣質為500 Da以上的水溶性酚類化合物，存在于70%以上的植物藥中，與許多藥物的抑菌活性有關[31]；玫瑰中芳香類與多酚類[23-32]，沙棘果中的黃酮、多糖[33-34]，異甘草素對于G+菌[35]，具有較強的抑菌活性。近20年來，盡管分子水平的中草藥化合物研究已全面展開，千葉蓍、駱駝蓬子等新疆常見中藥材中的化合物的分子作用機制尚不明確，有待進一步研究。

本實驗研究了35種中草藥對細菌的體外抑菌活性，得到的各MIC90值與文獻中記載的研究成果大致相似。但是，由于藥品品種、產地、提取工藝的差異，部分結果稍有不同。分級抑菌濃度結果(圖2.3～2.4)證明了中藥聯用可減少抗菌素的用量。與化學特征顯著的現代抗菌素“藥物”理念不同的是，民族民間醫學主張通過調節人體的“氣質”，從整體上提高機體的免疫力，以實現病灶的清除。受制于樣本來源單一、“南橘北枳”、未進行動物實驗，本實驗究仍然具有一定的局限性，有待后續研究予以加強。