ZM447439對(duì)乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力及凋亡的影響

張 月,王耀一,武雪亮,張志生,楊修明,姜 洋,喬志飛,梁晚平,薛 軍

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院乳腺外科,張家口 075000;*通訊作者,E-mail:xuejunhebei@163.com)

三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)發(fā)病年輕,就診時(shí)原發(fā)腫瘤大,組織學(xué)分級(jí)高,腋淋巴結(jié)陽性者較多,分期較晚,生物學(xué)上更具有侵襲性,由于TNBC缺乏雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)的表達(dá),傳統(tǒng)細(xì)胞毒性化療,仍然是治療三陰性乳腺癌的有效方法,可選擇藥物并不多,受到耐藥性的限制,治療方法有限,臨床預(yù)后差[1]。然而,目前尚無十分有效的靶向治療藥物,發(fā)掘新的治療靶點(diǎn)和開發(fā)新的藥物,改善三陰性乳腺癌的療效和預(yù)后,成為我們研究的重點(diǎn)。

ZM447439作為高選擇性Aurora A、B抑制劑,證實(shí)在急性骨髓淋巴細(xì)胞系可有效誘導(dǎo)凋亡[2],但關(guān)于ZM447439抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移方面研究較少,本研究通過探討ZM447439對(duì)Aurora激酶高表達(dá)的三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231凋亡和運(yùn)動(dòng)能力的影響及分子機(jī)制,從而為晚期乳腺癌的治療提供有效靶點(diǎn)、發(fā)掘有效抗癌藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

MDA-MB-231細(xì)胞系由河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)室傳代保存。ZM447439由Selleck chemicals公司惠贈(zèng)。RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibico公司;胎牛血清購(gòu)自新西蘭Hyclone公司;趨化小室購(gòu)自美國(guó)Neuro Probe公司;Fibronectin購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;BCA蛋白分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司;p-Aurora A、Aurora A、p-HistoneH3、HistoneH3、cdc25c、p-cdc25c、cdc2、p-cdc2、p-絲切蛋白(Cofilin-1)、Cofilin-1、Bcl-XL、Bcl-2、PARP、Caspase-3、β-actin一抗單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。染料Hochest 333342、Yo-Pro-1購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;Annexin Ⅴ/碘化丙啶(propidium iodide,PI)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD pharmingen公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖制率 取不同濃度(0,0.01,0.1,1,10 μmol/L)ZM447439分別處理MDA-MB-231細(xì)胞24,48 h后每孔加入MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清,加入二甲基亞砜震蕩充分溶解顯色,酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)各孔吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對(duì)照孔A值-加藥孔A值)/對(duì)照孔A值×100%。

1.2.2 細(xì)胞周期和DNA倍體分析 將進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)的MDA-MB-231細(xì)胞,分別用ZM447439濃度為0,1 μmol/L處理細(xì)胞48 h,收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106/ml,用冷PBS洗滌細(xì)胞,離心,預(yù)冷的95%乙醇固定,再離心,棄去乙醇,加入PI后,在流式細(xì)胞儀上機(jī)分析,檢測(cè)每管樣品1×104個(gè),并用Multicycle軟件進(jìn)行DNA倍體及細(xì)胞周期的分析。

1.2.3 熒光染料顯色法檢測(cè)細(xì)胞多核現(xiàn)象 MDA-MB-231細(xì)胞以適當(dāng)細(xì)胞濃度接種于6孔板中。將ZM447439以0,1,10 μmol/L預(yù)處理細(xì)胞24 h,PBS沖洗,1 μmol/L ZM447439處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h加入Hoechst 33342(5 μg/ml)染色液,Hoechst 33342是DNA特異性染料,將細(xì)胞核染為藍(lán)色,室溫孵育30 min后,倒置熒光顯微鏡下觀察多核細(xì)胞。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 ZM447439(0,0.1,1,10 μmol/L)處理MDA-MB-231細(xì)胞,24 h后收集細(xì)胞,用0 ℃預(yù)冷的PBS洗滌2次,調(diào)整細(xì)胞密度,取105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn),分別加Annexin Ⅴ 5 μl和PI(5 mg/L)5 μl,混勻,室溫避光孵育15 min后,加入500 μl結(jié)合緩沖液,4 ℃靜置30 min,在流式細(xì)胞儀上測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Western Blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax、PARP等)的表達(dá) ZM447439(0,0.01,0.1,1,10 μmol/L)處理細(xì)胞后進(jìn)行裂解、變性、進(jìn)行蛋白定量后電泳,分離蛋白,轉(zhuǎn)膜。封閉后將膜轉(zhuǎn)入p-Aurora A、Aurora A、p-Histone H3、Histone H3、CyclinB1、cdc25c、p-cdc25c、cdc2、p-cdc2、p-cofilin-1、Cofilin-1、Bcl-XL、Bcl-2和PARP一抗稀釋液(1 ∶1 000)中4 ℃過夜,二抗室溫孵育1 h,TBST洗膜3次后ECL顯影,于暗室曝光。

1.2.6 劃痕試驗(yàn) 將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后用滅菌10 μl槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕,用PBS洗兩次以洗去細(xì)胞碎片,加入ZM447439(0,0.01,0.1,1,10 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng),以0,3,6,12,24 h為時(shí)間梯度,在倒置顯微鏡下測(cè)量劃痕愈合程度,計(jì)算平均值。

1.2.7 趨化試驗(yàn) ZM447439(0,0.01,0.1,1,10 μmol/L)分別處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h,調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/ml,在Boyden趨化小室上室中加入,取0.001% Fibronectin包被后的聚碳酸酯膜置于趨化小室的上下室之間壓緊,在上室中加入上述細(xì)胞懸液250 μl,培養(yǎng)5 h后取出聚碳酸酯膜,將穿過膜的細(xì)胞固定染色后,在顯微鏡下(×40)隨機(jī)取3個(gè)視野,計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ZM447439抑制細(xì)胞增殖

MTT法顯示不同濃度ZM447439(0.01,0.1,1,10 μmol/L)分別作用24,48 h時(shí),在同一時(shí)間下隨著ZM447439藥物濃度的增加,細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加;在同一濃度下隨著ZM447339藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),ZM447439對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制作用具有劑量及時(shí)間依賴性,24 h的IC50值為(0.15±0.33)μmol/L,10 μmol/L ZM447439作用于MDA-MB-231細(xì)胞24,48 h增殖抑制率為(62.23±0.03)%和(84.17±0.01)%(見圖1)。

與0 μmol/L比較,*P<0.05圖1 ZM447439作用于MDA-MB-231細(xì)胞不同時(shí)間的抑制率Figure 1 Inhibition rate of MDA-MB-231 cell proliferation after treated with ZM447439 for different time by MTT

2.2 ZM447439誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞多核的形態(tài)學(xué)變化

與0μmol/L相比,1 μmol/L ZM447439作用于MDA-MB-231細(xì)胞48 h可見細(xì)胞核分葉,出現(xiàn)多核現(xiàn)象(見圖2)。

圖2 ZM447439作用于MDA-MB-231細(xì)胞48 h可誘導(dǎo)多核細(xì)胞 (×100)Figure 2 ZM447439 induced polynuclear of MDA-MB-231 after treatment for 48 h

2.3 ZM447439對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響

1 μmol/L ZM447439作用于MDA-MB-231細(xì)胞48 h出現(xiàn)了多倍體現(xiàn)象(見圖3),且0.1,1,10 μmol/L的ZM447439分別作用于MDA-MB-231細(xì)胞時(shí),凋亡率分別為(17.4±2.2)%,(28.5±3.1)%,(51.8±5.4)%。與對(duì)照組[(0.6±0.2)%]相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4),可見隨著ZM447439濃度的增加,細(xì)胞的凋亡率增加。Western blotting顯示,隨ZM447439濃度的增加,抗凋亡蛋白Bcl-XL、Bcl-2表達(dá)逐漸減少,而凋亡相關(guān)蛋白PARP剪切帶更加明顯(見圖5)。

1.G1峰;2.G2/M峰圖3 ZM447439作用48 h對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響Figure 3 Effects of ZM447439 on cell cycle of MDA-MB-231 at 48 h

圖4 ZM447439對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率的影響Figure 4 Effects of ZM447439 on apoptotic rate of MDA-MB-231

與0 μmol/L比較,*P<0.05圖5 ZM447439對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of ZM447439 on apoptotic proteins in MDA-MB-231 by Western blot

2.4 ZM447439對(duì)細(xì)胞劃痕愈合能力的影響

0 μmol/L ZM447439作用24 h劃痕已大部分愈合,而10 μmol/L ZM447439作用后劃痕愈合速度明顯慢于0 μmol/L ZM447439(見圖6)。同一時(shí)間不同濃度ZM447439(0.01,0.1,1,10 μmol/L)分別與0 μmol/L相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖6),不同時(shí)間、不同濃度對(duì)細(xì)胞劃痕愈合能力的影響不同,同一時(shí)間隨著藥物濃度增加遷移距離減慢,同一濃度隨著時(shí)間增加遷移距離減慢。

圖6 ZM447439對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響Figure 6 Effects of ZM447439 on migration of MDA-MB-231

2.5 ZM447439對(duì)細(xì)胞趨化能力的影響

0,0.01,0.1,1,10 μmol/L ZM447439作用后穿膜細(xì)胞數(shù)分別為每個(gè)高倍鏡視野下129.7±2.1,103.3±2.5,96.0±3.6,79.3±2.3,68.3±2.8,0.01,0.1,1,10 μmol/L ZM447439組穿膜細(xì)胞數(shù)分別與0 μmol/L組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖7)。隨著ZM447439濃度的增加,穿膜細(xì)胞數(shù)目減少。

圖7 ZM447439對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞趨化能力的影響Figure 7 Effects of ZM447439 on chemotaxis of MDA-MB-231

2.6 ZM447439對(duì)細(xì)胞Aurora A、Histone H3、cdc25c、cdc2、Cofilin-1磷酸化水平及CyclinB1的影響

隨著ZM447439濃度的增加,Aurora A、HistoneH3、Cofilin-1總蛋白表達(dá)沒有明顯變化,而相應(yīng)磷酸化蛋白逐漸減少,cdc25c、cdc2總蛋白表達(dá)沒有明顯變化,而相應(yīng)磷酸化蛋白逐漸增加(見圖8),提示ZM447439可以有效抑制Aurora激酶和Cofilin-1磷酸化水平及CyclinB1的表達(dá)。

圖8 Western blot對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 8 Effects of ZM447439 on expression of cell cyclin proteins in MDA-MB-231 by Western blot

3 討論

TNBC作為一種獨(dú)特的乳腺癌亞型,其臨床、病理以及分子生物學(xué)特征具有高度異質(zhì)性,有著某些獨(dú)特的生物學(xué)行為,其中95%TNBC為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌,只有1%-2%TNBC為浸潤(rùn)性小葉癌,在診斷TNBC的前3年內(nèi)早期復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移常見,肺、腦轉(zhuǎn)移率高,病情進(jìn)展快,對(duì)于gBRCA突變的TNBC,PARP抑制劑是可選擇的唯一靶向藥物,只有10%的TNBC存在gBRCA突變,TNBC腫瘤異質(zhì)性很高,PARP抑制劑并不適合所有TNBC患者,尋找新的靶點(diǎn)對(duì)于TNBC有著重要意義,Aurora激酶為TNBC的治療提供新的思路。

Aurora激酶家族屬于絲蘇氨酸激酶,在有絲分裂染色體線性結(jié)構(gòu)形成,胞質(zhì)分離中有重要作用,包括Aurora A、Aurora B、Aurora C三種,AuroraA位于近中心體區(qū)域,負(fù)責(zé)收集在有絲分裂中形成線粒體的重要物質(zhì),調(diào)節(jié)G2期向M期過渡,有研究證實(shí),到目前為止Aurora激酶家族中只有Aurora A是致癌基因[3-5]。Aurora B作為染色體信使蛋白在有絲分裂前中期位于中心體,在后期及末期位于微管中區(qū),Aurora B在染色體線性結(jié)構(gòu)形成,著絲點(diǎn)微管雙定位,紡錘體檢查點(diǎn)激活和細(xì)胞分裂中發(fā)揮作用,并且與組蛋白H3的磷酸化相關(guān)[6]。Aurora C位于染色體信使復(fù)合物中,在細(xì)胞周期中維持紡錘絲的整體性。

小分子Aurora激酶抑制劑ZM447439抑制TNBC細(xì)胞運(yùn)動(dòng),誘導(dǎo)凋亡從以下幾方面體現(xiàn):①ZM447439抑制TNBC細(xì)胞增殖:TNBC細(xì)胞周期的進(jìn)程啟動(dòng)是由細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)家族的成員與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合共同作用的,cyclinB1/CDK1在成熟促進(jìn)因子(MPF)中心有催化活性,在G2期不被激活,當(dāng)核胞膜破裂前被激活,有絲分裂前期激發(fā)一系列反應(yīng)[7]。磷酸化Aurora激酶減少可促進(jìn)cdc25c轉(zhuǎn)化為磷酸化cdc25c,cdc25c磷酸化使CDK1的Thr14位點(diǎn)(即cdc2)磷酸化從而抑制cyclinB1/CDK1活性,ZM447439抑制Aurora激酶向磷酸化Aurora激酶轉(zhuǎn)化,使磷酸化cdc25c和磷酸化cdc2的表達(dá)增加,從而抑制cyclinB1的表達(dá)[8],阻止G2期向M期過渡,抑制細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞術(shù)及Western blot證實(shí)了這一點(diǎn)。②ZM447439抑制TNBC細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移:TNBC細(xì)胞高侵襲性相關(guān)基因?yàn)镃ofilin-1,Cofilin-1蛋白是肌動(dòng)蛋白聚合和解聚的重要影響因子,促進(jìn)形成細(xì)胞膜偽足,決定了細(xì)胞遷移的方向,細(xì)胞發(fā)生侵襲。Cofilin-1和p-Cofilin-1激活/失活調(diào)控癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移[9,10]。Aurora A增加有活性的Cofilin-1在乳腺癌中的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞骨架重組,降低細(xì)胞間的黏附性,促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng),從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,Aurora激酶抑制劑可抑制乳腺癌細(xì)胞AuroraA的表達(dá),下調(diào)p-Cofilin-1的表達(dá),抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。③ZM447439誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞凋亡:ZM447439作為小分子Aurora激酶抑制劑可抑制Histone H3的磷酸化,使細(xì)胞核分裂失敗,乳腺癌細(xì)胞出現(xiàn)多核現(xiàn)象,胞質(zhì)分離失敗,形成多倍體細(xì)胞和很少部分二倍體細(xì)胞,最終為非整倍體,抑制G2/M過渡,誘導(dǎo)凋亡[12],使促凋亡蛋白表達(dá)增加,抑制凋亡蛋白表達(dá)減少,同時(shí)抑制磷酸化Aurora A的表達(dá),可引起G2/M期阻滯,抑制p-Cofilin-1的活性,從而抑制TNBC細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[13,14],本研究細(xì)胞劃痕試驗(yàn)和趨化試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。本研究中24 h的IC50值為(0.15±0.33)μmol/L,10 μmol/L ZM447439作用于MDA-MB-231細(xì)胞24,48 h增殖抑制率為(62.23±0.03)%和(84.17±0.01)%,隨著ZM447439藥物濃度的增加,細(xì)胞凋亡明顯增加,在0.1,1,10 μmol/L凋亡率分別為(17.4±2.2)%,(28.5±3.1)%和(51.8±5.4)%,ZM447439可以增加MDA-MB-231細(xì)胞p-cdc25c、p-cdc2的表達(dá),抑制CyclinB1,p-Cofilin-1表達(dá),從而抑制遷移及趨化的能力,從分子機(jī)制上闡釋了ZM447439具有抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用Bcl-2表達(dá)逐漸減少,Bax,PARP剪切增加,抑制增殖,促進(jìn)凋亡。

TNBC作為一個(gè)排他性診斷,事實(shí)上是一組異質(zhì)性很大的疾病,依靠現(xiàn)有的臨床和病理指標(biāo)難以對(duì)患者進(jìn)行個(gè)體化治療和預(yù)后分析,TNBC治療需要分而治之,從而達(dá)到改善患者治療策略及預(yù)后目的,尋找潛在治療靶點(diǎn)至關(guān)重要,ZM447439抑制MDA-MB-231細(xì)胞系增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的研究,為Aurora激酶可作為治療TNBC新的靶點(diǎn)和ZM447439作為治療TNBC新的藥物提供了理論依據(jù)。