miR-338-3p通過靶向RUNX2負調控人骨髓間充質干細胞成骨分化且促進骨質疏松

劉國樑，秦明照

(首都醫科大學附屬北京同仁醫院干部醫療/老年醫學科，北京 100730)

骨質疏松癥是一種內分泌和代謝性疾病，常伴隨并發骨礦物質密度和骨質量的降低[1-2]。導致患者易發生脆性骨折[3]。人骨髓間充質干細胞(human bone marrow stromal cells，hBMSCs)的分化調控參與多種分子途徑調控，在成骨性疾病的干細胞治療中顯示出較良好的潛力[4]。微核糖核酸(micro ribonucleic acids，miRNAs)通過調控靶基因的表達參與生物學過程，在骨骼發育、骨質疏松癥發病機制中發揮著重要作用，可作為治療骨類疾病的新的潛在靶點[5-6]。miRNA-153通過靶向II型骨形態發生蛋白受體抑制人間充質干細胞的成骨分化[7]。在成骨細胞分化過程中，miRNA-214的上調增加了骨質疏松小鼠間充質干細胞的數量[8]。RUNX2作為成骨細胞分化的關鍵調節因子，對正常骨骼發育和分化至關重要[9-10]。本研究通過探討miRNA-338-3p在hBMSCs成骨分化中的作用及其與RUNX2的相互關系，旨在為骨質疏松癥的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2019年12月首都醫科大學附屬北京同仁醫院收治的60例骨質疏松癥患者為研究對象。其中，男性36例，女性24例；平均年齡(73.12±8.27)歲；所有患者均符合骨質疏松癥的相關診斷標準[11]。排除標準：(1)惡性腫瘤患者；(2)合并腦出血或顱內出血史；(3)合并嚴重心、肝等系統性疾病者；(4)合并感染、自身免疫類疾病者。另選60名同期非骨質疏松者作為對照組。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 兩組一般資料比較

兩組入院時，收集其病歷資料，包括年齡、性別、體質指數、吸煙飲酒情況及合并基礎病等。入院后清晨，采集兩組靜脈血8 mL，靜置30 min后，4 ℃，3 000 g/min離心10 min。取上清(非溶血狀態)在4 ℃再次離心，135 000 g/min，持續15 min。隨后，將血清標本分裝，每管200 μL，-80℃ 保存備用。

1.2 hBMSCs的分離和培養

首先，采用骨髓粘連法從骨質疏松癥患者和對照組中提取10 mL新鮮骨髓置于無菌離心管中，采用密度梯度離心法分離hBMSCs細胞，倒置顯微鏡下觀察hBMSCs細胞生長情況及形態，選用第3代對數生長期細胞用于實驗研究[12]。分離的hBMSCs培養在phenol red-free α-minimum Eagle’s培養基中 (α-MEM；HyClone，Logan，UT，USA)，含10%胎牛血清 (FBS-HI)(Gibco，Grand Island，NY，USA)，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素(Gibco，Grand Island，NY，USA)。培養基每兩天更換1次，細胞傳代至90%融合度。然后，將hBMSCs在phenol red-free α-minimum Eagle’s培養基中培養 (α-MEM；HyClone，Logan，UT，USA)，含1%胎牛血清 (fetal bovine serum，FBS-HI)( Gibco，Grand Island，NY，USA)，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素(Gibco，Grand Island，NY，USA)，抗壞血酸50 μg/mL(Gibco，Grand Island，NY，USA)，10 mM甘油磷酸酯和0.1 μg /mL地塞米松(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，進行成骨誘導。每3 d更換1次成骨誘導培養基。

1.3 細胞轉染

miRNA-338-3p模擬物(miRNA-338-3p mimics，5’-GGGTCCAGCATCAGTGATT-3’)、miRNA-338-3p抑制劑(miRNA-338-3p inhibitor，5’-CCCAGGTCGTAGTCACTAA-3’)、RUNX2過表達質粒(RUNX2)或陰性對照(miR-NC)均購自上海基因制藥有限公司(中國上海)。按照Lipofectamine RNAIMAX轉染試劑盒(Invitrogen公司，美國)的說明書，將miRNA-338-3p模擬物、miRNA-338-3p抑制劑、RUNX2過表達質?；蜿幮詫φ辙D染到hBMSCs細胞系中。轉染前24 h，將融合度為75%的細胞接種于6孔板中培養；轉染當天將Lipofectamine RNAIMAX轉染試劑與opti-MEM培養液及合成的miRNA-338-3p模擬物、miRNA-338-3p抑制劑、RUNX2或陰性對照均勻混合，室溫孵育5～10 min后加入細胞培養液中；轉染48 h后，胰酶消化細胞，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗1次，保存備用。

1.4 RNA提取和實時定量PCR

嚴格按照TRIzol試劑操作說明(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取骨質疏松患者、對照組血清和hBMSCs中的總RNA。采用Nanodrop光譜儀(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)檢測RNA純度和濃度。隨后，使用逆轉錄系統將RNA反向轉錄為cDNA (Thermo Scientific，CA，USA)。采用ABI PRISM 7500序列檢測系統(ABI)，采用實時熒光定量PCR 2 x SYBR qPCR Mix(北京中曼生物技術有限公司，中國)檢測miR-338-3p的水平。擴增體系如下：PCR反應包含2 μL cDNA、0.4 μL正向引物、0.4 μL反向引物、7.2 μL H2O2和10 μL SYBR；擴增條件為25 ℃，10 min，48 ℃，30 min，95 ℃，5 min，U6作為實驗內參。SYBR Green檢測RUNX2蛋白、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、I型膠原蛋白(collagen I)mRNA表達水平，GAPDH作為實驗內參，采用2-ΔΔCt法計算表達水平。所用引物如表2。

表2 RT-qPCR引物序列

1.5 Western blot

為探討miR-338-3p對RUNX2蛋白表達的影響，采用冷的PBS洗滌hBMSCs兩次，然后用RIPA裂解緩沖液裂解(江蘇Beyotime生物技術研究所)和蛋白酶抑制劑(Roche，中國)提取所用總蛋白。使用BCA蛋白分析試劑盒(江蘇Beyotime生物技術研究所)對蛋白進行定量分析。取50 μg總蛋白上樣，經10% SDS-PAGE分離并轉移到PVDF膜上，在37 ℃下用5%脫脂乳封閉1 h，加入一抗(RUNX2 (1∶1 000；Abcam，USA))，GAPDH濃度1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜，隨后，將聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜用三乙醇胺緩沖鹽水溶液(tris buffered saline，TBS)洗滌3次，每次10 min。加入羊抗兔二抗(1∶1 000，Cell Signaling Technology Inc.，MA，USA)室溫孵育2 h，TBS洗滌3次，每次10 min。采用Fusion FX5圖像分析系統進行分析。

1.6 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測

用磷酸鹽緩沖溶液洗滌hBMSCs (PBS；Gibco，Grand Island，NY，USA)，用1% Triton X-100裂解15 min，10 000 g離心5 min。收集上清液，根據堿性磷酸酶測定試劑盒說明書測定堿性磷酸酶活性(DALP-250，Abcam，Cambridge，MA，USA)，采用酶標儀(Promega，Madison，WI，USA)在波長為450 nm下檢測光密度(optical density，OD)。

1.7 茜素紅染色

采用冷的PBS洗滌hBMSCs兩次，用70%乙醇預冷固定，吸去固定液，采用ddH2O洗滌hBMSCs 5次。隨后用40 mm茜素紅染色10～15 min，用ddH2O清洗5次。最后用倒置顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)觀察并捕獲鈣化結節(橙色)。

1.8 雙熒光素酶報告基因檢測

將hBMSCs細胞接種于24孔板中，轉染前孵育24 h，待細胞達到60%融合時，將miR-338-3p模擬物和miR-NC分別于RUNX2 3’-UTR野生型或突變型重組質粒共轉染。轉染48 h后，使用Renilla luciferase報告基因(pRL-CMV；Promega，USA)檢測熒光素酶活性。報告基因活性采用熒光素酶檢測試劑盒(Promega，USA)根據生產廠家的方案進行測定。所有實驗重復3次。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 miRNA-338-3p在骨質疏松患者血清中的表達情況

RT-qPCR分析顯示，骨質疏松患者血清中miRNA-338-3p水平相比健康對照組表達量上升(P<0.05)(圖1A)；此外，分別在0、7、14和21 d測定hBMSCs成骨分化中miRNA-338-3p的表達，數據顯示，miRNA-338-3p的表達隨著成骨誘導時間的延長而逐漸降低(P<0.05)(圖1B)。

2.2 miR-338-3p過表達對成骨分化相關標志物表達的影響

為了闡明miR-338-3p在成骨分化中的潛在功能，構建miR-338-3p模擬物和抑制劑，RT-qPCR檢測轉染hBMSCs后的效果發現，miR-338-3p模擬物和抑制劑轉染成功(圖2A)。miR-338-3p過表達下調了OCN、OPN和Collagen I mRNA的表達，相反，miR-338-3p敲低上調了OCN、OPN和Collagen I mRNA表達水平(圖2B-D)。與對照組相比，miR-338-3p過表達削弱了其礦化能力(P<0.05)(圖2E)。過表達miR-338-3p的hBMSCs細胞系中ALP活性下降(P<0.05)(圖2F)。

2.3 RUNX2是miR-338-3p的直接作用靶基因

生物信息學預測顯示，RUNX2基因的3’端非編碼區(3’UTR)包含了一個miR-338-3p的靶序列(圖3A)。在hBMSCs細胞系中，雙熒光素酶報告基因檢測進一步證實了RUNX2是miR-338-3p的直接靶點(WT：miR-NC(1.10±0.22)，miR-338-5p-mimic(0.45±0.05)；MT：miR-NC(0.98±0.16)，miR-338-5p-mimic(1.01±0.18)(圖3B)。此外，western blot和RT-qPCR分析表明，與對照組相比，miR-338-3p過表達降低了RUNX2的mRNA和蛋白表達水平(圖3C-D)；相反，miR-338-3p敲低上調了RUNX2的mRNA和蛋白表達水平(圖3C-D)。

2.4 miR-338-3p通過抑制RUNX2的表達抑制成骨分化

為進一步探討miR-338-3p在成骨分化中的作用機制，在hBMSCs細胞系中分別轉染miR-NC、miR-338-3p模擬物和miR-338-3p模擬物+RUNX2。結果表明，過表達miR-338-3p可顯著降低ALP活性，而RUNX2過表達可以逆轉這一現象(圖4A)。同樣，茜素紅染色顯示，過表達miR-338-3p的hBMSCs細胞系礦化能力明顯受到抑制，而通過共轉染miR-338-3pp模擬物和RUNX2，礦化程度進一步升高(圖4B)。過表達miR-338-3p，OCN、OPN和collagen I mRNA的相對表達水平下調。而在RUNX2過表達后，OCN、OPN和collagen I mRNA水平升高(圖4C-E)。

3 討論

骨質疏松癥是一種常見的復雜疾病，其主要表現為骨骼微結構惡化，強度受損，使之更易發生骨脆性骨折[13]。據估計，全球骨質疏松癥的患病人數超過7 500萬人，每年與骨質疏松癥相關的骨折超過150萬人，到2050年髖部骨折預計將達到630萬人[14-15]。骨骼的微觀結構由礦化的細胞外基質和骨重塑單元組成，包括骨細胞，成骨細胞，破骨細胞等[16]。破骨細胞和成骨細胞對于骨骼的維持和重塑至關重要。骨形成和骨吸收之間的不平衡會導致代謝性骨疾病，如骨吸收的過程快于新骨的形成，骨質疏松癥將會發生[17]。本研究發現，骨質疏松患者血清miR-338-3p水平相比對照組表達量明顯上升，miR-338-3p過表達影響OCN、OPN和Collagen I mRNA的水平,且明顯削弱了hBMSCs礦化能力和ALP活性。雙熒光素酶報告基因檢測證實，RUNX2是miR-338-3p的直接靶點。RUNX2過表達可逆轉miR-338-3p 對hBMSCs成骨分化的抑制作用?？梢?，miR-338-3p通過靶向RUNX2負調控hBMSCs的成骨分化，從而促進骨質疏松的進展。

miRNA是長度為20～22個堿基的小型非編碼RNA，被認為是一種重要的表觀遺傳修飾分子，可通過影響細胞分化和凋亡來介導目標基因的轉錄后調控[18]。miRNA在破骨細胞和成骨細胞生長和分化中的作用已得到廣泛的研究[19]。其中成骨細胞的分化是骨穩態的重要過程， miRNA可以調節成骨細胞分化的生物學過程[20]。有研究[21]表明，miR-375通過靶向RUNX2抑制成骨細胞分化，同時降低了一些關鍵的成骨細胞標志物的活性。miR-96通過抑制成骨細胞中HB-EGF/EGF受體信號傳導來促進成骨細胞分化[22]。本研究發現，骨質疏松患者血清中miRNA-338-3p水平相比健康對照組表達量明顯上升，此外，分別在0、7、14和21 d測定hBMSCs成骨分化中miR-338-3p的表達數據顯示，miR-338-3p的表達隨著成骨誘導時間的延長而逐漸降低。可見，miR-338-3p可能通過抑制成骨分化，進而影響骨質疏松癥的進展。

miR-338-3p通過下調WNT2B蛋白增強卵巢癌細胞對順鉑的敏感性[23]，通過抑制MACC1基因阻礙結直腸癌的進展[24]，通過靶向蛋白磷酸酶4調節亞單位1(protein phosphatase 4 regulator subunit 1，PP4R1)調節蛋白磷酸酶4 (protein phosphatase 4，PP4)表達來介導肝細胞核因子4α(hepatic nuclear factor 4α，HNF-4α)[25]。miR-338-3p的過表達還可抑制成骨細胞分化標記物的表達，從而減少成骨細胞分化[26]?？梢姡琺iR-338-3p有可能成為治療多種疾病的潛在靶點，且與骨質疏松癥的發生及發展密切相關。ALP、Collagen I是早期成骨分化的標志物，而OCN和OPN是其晚期分化的標志物[27]。本研究發現，miR-338-3p過表達顯著下調了OCN、OPN和Collagen I mRNA的表達，相反，miR-338-3p敲低上調了OCN、OPN和Collagen I mRNA表達水平。此外，miR-338-3p過表達削弱了hBMSCs礦化能力和ALP活性，表明miR-338-3p對成骨分化具有較明顯的抑制作用。

hBMSCs在成骨分化的過程中有多種轉錄因子參與調節，如RUNX2/Cbfa1、Osx等[28]。其中RUNX2對于成骨細胞分化和軟骨細胞成熟至關重要。RUNX2在成骨細胞和軟骨細胞中均有表達，在敲除RUNX2的小鼠中，成骨細胞和骨形成，軟骨細胞成熟均明顯受到抑制[29]。近年來，有研究[30]發現，miRNA通過調控RUNX2的表達來影響成骨分化。如，miR-133通過靶向RUNX2抑制小鼠C2C12細胞分化為成骨細胞。Kim等[31]發現，上調小鼠C3H10T1/2細胞中的miR-433，可直接抑制RUNX2和BMP-2的轉錄后水平。Vimalraj等[32]證明了Smurf1通過蛋白酶體途徑降解RUNX2。而在BMSCs中，miR-15b通過下調Smurf1可上調RUNX2水平?？梢姡琑UNX2與上下游分子相互作用，進一步影響骨骼的生長發育，在骨質疏松癥中起重要作用。本研究通過生物信息學預測顯示，RUNX2基因的3’UTR包含了一個miR-338-3p的靶序列，雙熒光素酶報告基因檢測進一步證實了RUNX2是miR-338-3p的直接靶點。miR-338-3p過表達降低了RUNX2的mRNA和蛋白表達水平。而RUNX2過表達可以逆轉miR-338-3p對成骨分化的抑制作用?？梢?，RUNX2在骨質疏松癥中至關重要。

綜上所述，miR-338-3p在骨質疏松中高表達，隨著成骨分化時間的延長其表達逐漸減少。此外，miR-338-3p通過靶向RUNX2負調控hBMSCs的成骨分化，從而促進骨質疏松的進展。