lncRNA ANRIL rs2383207及其交互效應與急性缺血性腦卒中早期神經功能惡化的關系

黃燕，周嬙，陳小靈，唐志，何發毅，馮玉環，柳華,

(1.鹽亭縣人民醫院神經內科，四川 綿陽 621600；2.成都市第三人民醫院·西南交通大學附屬醫院神經內科，四川 成都 610031；3.鹽亭縣人民醫院神經外科，四川 綿陽 621600)

腦血管病的致死率在我國位居首位，其中缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)是主要的腦血管事件，約占所有卒中的80%。部分CIS患者發病后癥狀體征趨于惡化，即早期神經功能惡化(early neurologic deterioration，END)。急性CIS期間END較常見，臨床發生率可高達40%。END與卒中后結局不良密切相關，增加了患者死亡率[1]。因此，研究END預測因素加以有效防控極其重要。END發生危險因素眾多[2]，由于CIS是一種具有強烈遺傳背景的多因素疾病，且CIS與END病理生理機制類似，因而END的易感基因研究有一定的必要性。位于9p21.3區域上的INK4座中反義非編碼RNA (antisense non-coding RNA in the INK4 locus，ANRIL)基因與動脈粥樣硬化風險密切相關，ANRIL rs2383207則是CIS發病的易感位點[3]。本研究擬探討ANRIL rs2383207位點及其與傳統危險因素的交互效應對急性CIS期間END的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用前瞻性巢式病例對照研究設計，連續收集從2017年12月至2019年6月鹽亭縣人民醫院神經內科收治的急性CIS患者。納入標準為：(1) CIS診斷符合世界衛生組織(World Health Organization，WHO)標準：電子計算機斷層掃描/磁共振成像(computed tomography/ magnetic resonance imaging，CT / MRI)檢查及臨床表現，急性起病、局灶神經功能缺損并持續性24 h以上、排除非血管性病因，排除腦出血和蛛網膜下腔出血；(2) 發病48 h內入院；(3)同意參與研究。排除有明確原因的繼發性腦梗死患者和合并嚴重其它嚴重疾病的患者，另外，也排除了住院不滿7 d者、接受靜脈溶栓和血管內介入治療者及出血轉化的患者。醫院倫理委員會批準了本研究，參與研究者簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集與評估 入院24 h內，收集所有研究對象的臨床資料，包括：(1)人口學特征：年齡、性別、身高、體重，并計算身體質量指數(body mass index，BMI)；(2)腦血管病危險因素：如高血壓、糖尿病、血脂異常、心房顫動、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、卒中、吸煙、飲酒等；(3)部分實驗室指標：入院空腹血糖、血常規、凝血功能，血液生化指標 [包括超敏C反應蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hsCRP)，血同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)等]。

1.2.2 研究指標 (1)使用美國國立衛生研究院卒中量表(national Institute of Health stroke scale，NIHSS)評估神經功能缺損程度；(2)END定義為入院一周NIHSS評分中運動功能項增加至少1分或總分增加至少2分[4]；(3)高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHCY)定義為血漿Hcy >10 μmol/L；(4)高危CRP定義hsCRP>3.0 mg/L[5]；(5)高尿酸定義為非同日2次血尿酸水平>420 μmol /L[6]；(6)神經功能損傷程度較重定義為NIHSS > 5[7]；(7)入院高血糖根據1998年WHO標準：空腹 ≥7.0 mmol /L，或隨機 ≥11.1 mmol /L；(8)入院高血壓根據1999年WHO高血壓標準：即收縮壓 ≥ 140 mmHg(和/或)舒張壓 ≥ 90 mmHg；(9)吸煙史定義為平均每日吸煙1支以上，時間大于1年；飲酒史定義為平均每周飲白酒至少1次，時間大于1年[8]；(10)血脂異常依據2016年修訂版中國成人血脂異常防治指南：甘油三酯(triglyceride，TG)> 1.7 mmol/L(150 mg/dL)、血清總膽固醇(serum total cholesterol，TC)> 5.20 mmol/L (200 mg/dL)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)> 3.40 mmol/L(140 mg/dL)；(11)超重定義為BMI≧24 kg/m2。

1.2.3 rs2383207位點分型 (1)樣本脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)獲取：取受試者外周靜脈血2 mL，枸櫞酸鈉抗凝，使用血液基因組DNA提取試劑盒(DP318-02/03，北京TIANGEN)按說明操作。(2)基因分型：采用imLDR多重SNP分型平臺(上海天昊)[9]。具體操作步驟如下：①DNA樣本工作濃度為5～10 ng/μL；②多重聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)：反應體系10 μL包括1×GC-I buffer(Takara)，3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStar Taq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μL樣本DNA和1 μL引物，見表1。循環程序為：首先95 ℃循環 2 min；第二步進行11個循環[94 ℃ 20 sec、65 ℃ 40 sec(每次循環依次降低 0.5 ℃)、72 ℃ 1.5 min]；第三步進行24個循環(94 ℃ 20 sec，59 ℃ 30sec，72℃ 1.5 min)；第四步72 ℃ 循環2 min，4 ℃保存；③PCR產物純化：10 μL PCR產物加5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37 ℃溫浴1 h，75 ℃滅活15 min；④連接反應：反應體系為10×連接緩沖液1 μL、高溫連接酶 0.25 μL、5’連接引物混合液(1 μM) 0.4 μL、3’連接引物混合液(2 μM) 0.4 μL(表1)、純化后的多重PCR產物 2 μL、ddH2O 6 μL 混勻。連接程序首先進行38個循環(94 ℃ 1 min，56 ℃ 4 min)，4 ℃保存；⑤測序及分析：取0.5 μL 稀釋后的連接產物與0.5 μL Liz500 SIZE STANDARD和9 μL Hi-Di 混勻，95 ℃變性5 min后上ABI 3730XL測序儀，收集的原始數據用GeneMapper 4.1 (ABI，USA) 進行分析。

表1 SNP分型所用引物名稱及序列

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 一般資料分析

391例CIS患者納入分析，116例發生END(29.7%)，非END共275例(70.3%)。兩組在的性別、年齡差異方面無統計學意義，具有可比性(P>0.05)。單因素分析發現，END組NIHSS>5評分、入院高血糖、HHCY和高危hsCRP值比例明顯高于非END組(P<0.05)。多元Logtic回歸分析調整協變量后，兩組NIHSS>5評分，入院高血糖和HHCY差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 納入研究對象的特點及Logistic回歸分析

2.2 rs2383207 SNP分析

2.2.1 基因分型及相關性分析 所有樣本都成功進行了rs2383207位點分型，在顯性模型下，GG型增加了END風險(調整后的GG基因型：OR=2.143，95%CI：1.293-3.550，P=0.003)；在等位基因比較模型下，A等位基因具有保護效應，降低了END發生風險(OR=0.691,95% CI：0.497-0.961，P=0.028)。見表3。

表3 不同遺傳模型下rs2383207位點在END組和非END組中的分布

2.2.2 ANRIL基因rs2383207和END傳統危險因素的交互分析 將END單因素分析中P<0.1的因素(年齡≥65、WBC異常、TIA史、飲酒、糖尿病史、高危hsCRP、HHCY、入院高血糖和NIHSS>5評分項)與391條樣本記錄資料導入MDR軟件，作了1-4階不同交互情況下的模型。結果顯示，二階交互模型rs2383207和NIHSS>5評分具有最好的平均檢驗準確度和交叉驗證一致性(Testing BA：0.593 3，CVC：9/10，P=0.286)，因此選擇此模型作為最佳模型，Logtic回歸分析顯示NIHSS>5分人群同時攜帶rs2383207 GG基因型END發生風險增加，但是沒有顯示出統計學差異(OR=1.696，95%CI:0.607～4.736，P=0.313)。見表4。

表4 rs2383207 SNP與傳統危險因素基于1-4階交互作用分析

3 討論

本研究顯示，急性CIS入院7 d內END發生率為29.7%。Hu等[10]研究表明，在中國人群中，住院CIS患者7 d內END發病率為20.2%～42.5%，與本研究類似。

入院NIHSS>5分、入院高血糖和HHCY的患者更容易發生END。END發生機制包括缺乏有效側枝循環、血栓進展、卒中復發、顱內壓增加、癲癇和出血轉化等。NIHSS評分與腦梗死或水腫面積密切相關，梗死后的多種并發癥及氧自由基釋放可能是患者發生END的重要原因，并且卒中的嚴重程度與END發生率成正比[11]。這可能是由于空腹血糖升高可導致腦組織乳酸和氧自由基等有害物質產出增加，加重腦細胞損傷；高血糖具有血栓前效應，可能促使血栓擴展；高血糖微血管病變可影響側枝循環，使患者對血壓變動更敏感，由此加重低灌注風險，與Jaume等[12]研究基本一致。HCY參與血管內皮損傷后修復、血管平滑肌增殖過程，與動脈粥樣硬化、血栓形成有關，而HHCY血癥是腦血管疾病的高危因素，降低HCY的卒中患者預后較好[13]。且HHCY也是預測END的獨立危險因素[4]，由于HCY與人群END風險密切相關[14]。

本研究發現，rs2383207 GG型增加了END風險，A等位基因具有保護效應。ANRIL與心腦血管事件密切相關，其中ANRIL rs2383207位點與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病和CIS的發病風險息息相關[15-18]。由此推測，ANRIL rs2383207可能參與了CIS-END 發病。

本研究進行了ANRIL基因rs2383207位點與END傳統危險因素交互作用分析，rs2383207位點與NIHSSS>5兩個因素間的交互效應可能與END風險有關，盡管在最后的驗證中未見統計學差異，但仍可推測，END的發病可能在一定程度上與遺傳和環境多種因素交互作用相關，且在遺傳易感性基礎上，發病時的神經功能受損的嚴重程度可能會增加END的發生風險。

綜上所述，ANRIL基因、入院高血糖、HHCY和神經功能缺損程度與急性CIS后END發病有關，END傳統危險因素和易感基因間的交互作用可能參與了END的發病。