茶鮮葉揮發物組分及對茶樹病原菌的熏蒸抑制作用

智亞楠，徐運飛，朱明星，王春生，金銀利，陳利軍*

茶鮮葉揮發物組分及對茶樹病原菌的熏蒸抑制作用

智亞楠1,2，徐運飛1，朱明星1，王春生1,2，金銀利1,2，陳利軍1,2*

1.信陽農林學院農學院，河南 信陽 464000；2.河南省豫南農作物有害生物綠色防控院士工作站，河南 信陽 464000

為明確茶鮮葉中的揮發物組分及其與茶樹主要病原菌之間的關系，利用HS-SPME-GC-MS法萃取分析茶鮮葉揮發物組分，并以茶褐枯病菌、茶云紋葉枯病菌、茶炭疽病菌、茶輪斑病菌為目標菌，測定茶鮮葉主要揮發物單體組分對病原菌的熏蒸抑制作用。結果顯示，從茶鮮葉揮發物中分離到28個組分，鑒定出其中19個組分，占揮發物總量的94.405%，其主要組分為()-己酸-3-己烯酯（18.395%）、乙酸葉醇酯（16.935%）、羅勒烯（12.615%）和順-3-己烯基丁酯（11.210%），其中順-3-己烯基丁酯對4種病原菌均具有熏蒸抑制作用，EC50均低于61.29?μL·L-1。結果表明，順-3-己烯基丁酯有作為熏蒸型殺菌劑應用于茶樹病害防控的潛力。

茶鮮葉；熏蒸；抑菌活性；揮發物；順-3-己烯基丁酯

植物在生長過程中會釋放大量的揮發性物質（Volatile organic compounds，VOCs），作物在田間釋放的揮發物是作物與其他生物交流的復雜的高級“語言”，具有直接或間接影響天敵、植食性昆蟲和病原菌的生態功能，這些揮發物可以通過化感作用以生態調控方式防控植物病蟲害。因此，植物揮發物是植物病蟲害綠色防控的重要資源[1-2]。近年來，國內外學者對茶樹揮發物與植食性昆蟲間的關系進行了大量研究，例如，有研究發現小貫小綠葉蟬（G?the）成蟲對健康茶梢和蟬害茶梢揮發物具有不同的行為反應[3-4]。茶樹受茶刺蛾（Moore）危害和未危害的枝葉釋放的有機揮發物種類存在較大的差異，茶樹受害后，釋放的揮發物能明顯吸引茶刺蛾天敵棒須刺蛾寄蠅（Chao）[5]。茶樹芽梢的揮發物是害蟲向茶樹定位的信息物質，茶尺蠖（Prout）、茶蚜（Boyer）對芳樟醇、香葉醇等揮發物具有較強的趨性[6]。而茶樹揮發物與植物病原菌的關系研究較少。有研究認為植物揮發物的許多組分具有抗菌活性，與植物抗病防御相關，植物受病原菌侵染后，能夠釋放出與健康植株不同的揮發物[7-8]。有研究發現茶葉中揮發物香葉醇含量和茶樹茶云紋葉枯病抗性之間可能存在一定關系[9]。Zhang等[10]報道，茶葉揮發物芳樟醇、水楊酸甲酯（MeSA）、苯乙醇對茶云紋葉枯病菌有較強的抑制作用。張春花等[11]發現云南大葉種健康茶樹和受茶餅病侵染的茶樹揮發物存在差異，受害葉片新增的揮發物組分可能具有植株間通訊或者增強受害葉片防御功能的作用。

為了明確茶鮮葉揮發物的化學組分及主要揮發物單體與茶樹病害的關系，本研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯用（HS-SPME-GC-MS）技術，測定信陽茶樹健康鮮葉中揮發物的組分，并以主要組分單體為研究對象，測定其對茶樹主要病害病原菌的熏蒸抑制作用。為茶樹資源利用、安全有效地控制茶樹病害奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茶樹鮮葉：健康葉，于2019年5月采自信陽震雷山茶園，茶樹品種為龍井43。

培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基：馬鈴薯200?g、葡萄糖18?g、瓊脂17?g、水1?000?mL。

植物病原真菌：茶褐枯病菌（）、茶云紋葉枯病菌（）、茶炭疽病菌（）、茶輪斑病菌（），均由信陽農林學院植物病理實驗室分離保存。

主要儀器與設備：Agilent 6850/5975氣質聯用儀（美國Agilent公司）、NIST14譜庫、HP-250S 生化培養箱（武漢瑞華儀器設備有限責任公司）、手動SPME進樣器和50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（美國Supelco公司）等。

主要試劑：順-3-己烯基丁酯（美國Sigma-Aldrich公司），羅勒烯、乙酸葉醇酯和()-己酸-3-己烯酯（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶鮮葉揮發物組分萃取

頂空固相微萃取法（HS-SPME）萃取收集茶樹鮮葉揮發物。將采集的鮮葉置于頂空樣品瓶中，加蓋密封，萃取頭使用前在260℃的氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）進樣口中活化30?min。25℃條件下頂空萃取2?h，萃取結束后將萃取頭插入GC-MS進樣口解吸附5?min，然后進行GC-MS分析。

1.2.2 揮發物GC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱為HP-5ms毛細管柱（30?m×0.25?mm×0.25?μm）；進樣口溫度260℃；程序升溫，初始柱溫為60℃，保持2?min，以10℃·min-1升溫速率升至230℃，保持1?min；載氣為高純氦氣，流速為1.0?mL·min-1，進樣量為1.0?μL，不分流。

質譜條件：EI離子源，電子能量70?eV，離子阱溫度220℃，傳輸線溫度280℃，全掃描方式，掃描范圍33～350?amu。

1.2.3 揮發物單體組分熏蒸抑制作用測定

揮發物單體組分對植物病原真菌菌絲生長的熏蒸抑制作用采用生長速率法測定[12]。在直徑90?mm的培養皿中加入15?mL融化的培養基，搖勻制成薄厚均勻平板，平板中央接種一塊直徑為5?mm的植物病原真菌菌餅。然后在皿蓋上放置一滅菌的直徑為7?mm的圓形濾紙，吸取一定劑量的單體組分滴加到濾紙片上，使培養皿內揮發物單體達到一定濃度，共設5個濃度（D1：26.67?μL·L-1、D2：53.33?μL·L-1、D3：80.00?μL·L-1、D4：106.67?μL·L-1、D5：133.33?μL·L-1），以僅放濾紙片不滴加單體組分為對照。用封口膜密封后在25℃培養箱中倒置培養72?h后觀察菌絲生長情況，并用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率。試驗每處理重復3次。

抑菌率=(對照菌落生長直徑－處理菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑×100%

1.2.4 順-3-己烯基丁酯對茶輪斑病菌菌絲形態影響觀察

取培養40?h的茶樹輪斑病菌平板（90?mm），皿蓋中間放入濾紙片，濾紙片上添加順-3-己烯基丁酯單體，濃度為其對茶樹輪斑病菌熏蒸抑制作用的EC50、EC90，封口膜密封后倒置在25℃培養箱中培養，以只放濾紙片不加揮發物單體組分為對照。24?h后觀察菌落形態，光學顯微鏡觀察菌落邊緣菌絲形態[13]。

1.2.5 數據統計與分析

試驗數據采用Excel 2010進行初步整理分析，利用SPSS 22.0統計分析軟件對抑菌率進行單因素方差分析，Duncan新復極差法進行處理間差異顯著性檢驗。同時利用SPSS 22.0軟件繪制標準曲線，建立毒力回歸方程，并計算相關系數、EC50和EC90。

2 結果與分析

2.1 茶鮮葉揮發物組分分析

利用HS-SPME，經過吸附和解析，富集茶樹鮮葉的揮發物物質，通過GC-MS分析，利用色譜峰面積歸一化法測得各組分的相對含量，所得質譜圖經NIST14質譜數據庫檢索，與標準圖譜核對，并結合化學物質登錄號（CAS號）分析。從茶鮮葉中共分離到28個揮發物組分（表1），鑒定出其中的19個揮發物組分，占總揮發物組分的94.405%。

從表1中可以看出，其揮發油中含量最高的組分是()-己酸-3-己烯酯，相對含量達18.395%；其次是乙酸葉醇酯、羅勒烯和順-3-己烯基丁酯，其相對含量分別為16.935%、12.615%和11.210%。

2.2 4種主要揮發物單體組分對茶樹輪斑病菌的熏蒸抑制作用

采用生長速率法測定茶樹枝葉揮發物中含量最高的4種組分()-己酸-3-己烯酯、乙酸葉醇酯、羅勒烯、順-3-己烯基丁酯對茶樹輪斑病菌的熏蒸抑菌活性（表2）。結果表明，4種組分對茶輪斑病菌都有一定的熏蒸抑制作用，抑菌強弱排序為順-3-己烯基丁酯>乙酸葉醇酯>()-己酸-3-己烯酯>羅勒烯。順-3-己烯基丁酯在133.33?μL·L-1時對茶樹輪斑病菌的熏蒸抑制率達到了93.13%，而另外3種單體的抑制率均在50%以下。

2.3 順-3-己烯基丁酯對茶樹主要病原菌的熏蒸抑制作用

由圖1和表3可知，順-3-己烯基丁酯對4種茶樹主要病原菌有著很好的熏蒸抑制作用，在133.33?μL·L-1時，抑菌率在71.96%～93.13%。順-3-己烯基丁酯對植物病原真菌菌絲生長的毒力測定結果如表4所示，由EC50可看出：順-3-己烯基丁酯對4種茶樹病原菌的EC50均在61.29?μL·L-1以下，其中對茶褐枯病菌的抑制作用最強，EC50為35.41?μL·L-1。對茶樹炭疽病菌的EC90最大，僅為327.57?μL·L-1。

2.4 順-3-己烯基丁酯對茶樹輪斑病菌菌絲形態影響

順-3-己烯基丁酯對茶樹輪斑病菌的菌絲形態有一定的影響。熏蒸處理24?h后光學顯微鏡觀察，對照組茶樹輪斑病菌的菌絲正常生長伸長、表面光滑、菌絲粗細均勻，菌絲體邊緣稀疏（圖2-a）。經過EC50濃度處理的茶樹輪斑病菌，菌絲局部增粗，邊緣較為密集（圖2-b）；濃度為EC90時菌絲變形、出現顏色分段加深的現象，部分菌絲局部膨大、原生質外滲，在菌絲頂端聚集（圖2-c和圖2-d）。

表1 茶鮮葉揮發物的化學組分分析

表2 4種茶鮮葉中揮發物單體組分對茶樹輪斑病菌的熏蒸抑制率（±SE）

注：同行數據后不同小寫字母表示差異顯著(＜0.05)

Note: The different lowercase letters represent significant difference under different treatments (＜0.05)

注：各圖中，第一排左起濃度依次為0、D1、D2，第二排左起依次為D3、D4、D5

Note: The concentration in the first row from left is 0, D1 and D2 in 4 sub-graphs, the second row from left is D3, D4 and D5

圖1 順-3-己烯基丁酯對茶樹4種菌的熏蒸抑制作用

Fig.1 Fumigation antifungal activity of-3-hexenyl butyrate against 4 fungal pathogens of tea plants

表3 順-3-己烯基丁酯對4種茶樹病原真菌的熏蒸抑制率（±SE）

注：同行數據后不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）

Note: The different lowercase letters represent significant difference under different treatments (＜0.05)

表4 順-3-己烯基丁酯對4種茶樹病原真菌的毒力測定結果

注：a：對照；b：EC50濃度處理；c和d：EC90濃度處理

Note: a: CK.b: treatment at EC50.c & d: treatment at EC90

圖2 順-3-己烯基丁酯對茶樹輪斑病菌菌絲作用顯微觀察

Fig.2 Fumigation antifungal activity of-3-hexenyl butyrate against the mycelia morphology ofby optical microscope

3 討論

茶葉是人們日常生活中的重要飲品，消費者對其安全性尤為關注。當前，茶樹病害的防治尚以化學農藥為主，大量化學農藥的頻繁使用，造成諸多負面影響，從植物資源中尋找具有抑菌活性的物質已經成為新型農藥的研究方向。

植物在長期與自身病害的斗爭中，體內會產生一些具有抗菌活性的化學物質，利用植物中的這些活性物質防治植物病害逐漸成為植保工作者的研究熱點。植物體內含有的揮發油是常見的抑菌活性成分，例如陳利軍等[14-15]研究發現，留蘭香、小魚仙草等植物揮發油對番茄灰霉病菌、小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌和萵苣菌核病菌有強烈的熏蒸抑制作用。

Sellamuthu等[16]研究發現百里香精油蒸氣可顯著抑制鱷梨炭疽病的發生。但植物揮發油的組分受植物生境、揮發油提取方法等影響，組分和含量有差別，抑菌效果不穩定，難以直接在生產中使用；而利用植物揮發物中的單體組分進行抑菌作用研究，不僅抑菌效果穩定，而且更適合于制劑的開發，可作為新一代環境友好型農藥。例如存在于百里香、牛至等植物中的揮發物成分香芹酚對多種農作物、果蔬病原菌具有很好的抑制作用，已被開發為水劑、可溶液劑，被登記用于番茄灰霉病、枸杞白粉病、馬鈴薯晚疫病、棗樹銹病等植物病害的防治[17-21]。存在于丁香（Thunb.）中的丁子香酚也被登記用于番茄灰霉病、番茄晚疫病、葡萄霜霉病等病害的防治[21-22]。

本研究利用HS-SPME-GC-MS法，富集茶鮮葉的揮發物組分并進行分析發現，茶鮮葉揮發物組分主要為()-己酸-3-己烯酯、乙酸葉醇酯、羅勒烯、順-3-己烯基丁酯等，此4種組分在前人對茶樹揮發物的研究中也有發現，但含量差異較大。如王潤賢等[23]對10個不同品種的春、秋茶鮮葉揮發物化合物進行檢測，發現含量較高的組分為乙酸葉醇酯、()-己酸-3-己烯酯、芳樟醇、水楊酸甲酯、順-3-己烯基丁酯、己酸-反-2-己烯酯等。朱蔭等[24]發現不同品種龍井茶中相對含量較高的香氣成分基本都以芳樟醇、()-己酸-3-己烯酯、檸檬烯、茉莉酮等為主，也具有一定含量的順-3-己烯基丁酯。龍立梅等[25]對西湖龍井、黃山毛峰和信陽毛尖3種名優綠茶特征香氣成分進行分析研究發現，成品信陽毛尖中()-己酸-3-己烯酯和順-3-己烯基丁酯，含量分別為4.85%和4.16%。王夢馨等[4]發現健康茶梢和蟬害茶梢揮發物中均含有乙酸葉醇酯、羅勒烯。

當前，尋求無害化的植物病蟲害防控技術是植保領域的研究熱點。揮發物能在田間高效率的擴散，通過化感作用以生態調控方式防控植物病蟲害，是植物病蟲害理想的無害化防控技術之一。目前茶樹揮發物生物活性的報道較少，農用活性及其作用機制尚不明確且研究大多局限于揮發物與害蟲發生的關系上，較少涉及到某個單體化合物的抑菌活性方面。本研究通過對茶鮮葉中的4種主要揮發物成分進行抑菌測定發現，順-3-己烯基丁酯對茶云紋葉枯病菌、茶炭疽病菌、茶輪斑病菌、茶褐枯病菌均有很好的熏蒸抑制作用，EC50均在61.29?μL·L-1以下，表明順-3-己烯基丁酯是茶樹本身存在的抗菌活性物質，在極低濃度下即可熏蒸抑制病原菌。但茶鮮葉的揮發物釋放量極微，而且順-3-己烯基丁酯在茶鮮葉揮發物中的相對含量也僅為11.210%，因此通過茶樹自身釋放的順-3-己烯基丁酯在田間對植物病原菌的熏蒸抑制作用有限。由于順-3-己烯基丁酯來源于自然界，環境相容性好，符合綠色農藥的要求，其單體物質具有作為熏蒸型殺菌劑用于茶園病害的無害化防控的潛力。下一步，可在此基礎上深入研究，探討其在生產上用于植物病害防控的可能性。

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Volatile Organic Compounds from Fresh Tea Leaves and Their Fumigation Antifungal Activities on Fungal Pathogensof Tea Plants

ZHI Yanan1,2, XU Yunfei1, ZHU Mingxing1, WANG Chunsheng1,2, JIN Yinli1,2, CHEN Lijun1,2*

1.Agriculture College, Xinyang Agriculture and Forestry University, Xinyang 464000, China; 2.Henan Provincial South Henan Crop Pest Green Prevention and Control Academician Workstation, Xinyang 464000, China

In order to determine the relationship between volatile organic compounds (VOCs) from fresh tea leaves and the main fungal pathogens of tea plants, the VOCs from fresh tea leaves were extracted and analyzed by HS-SPME-GC-MS.The fumigation antifungal activities of volatile monomers from fresh tea leaves against four fungal pathogens including,,,were also studied.The results show that 28 chemical compounds were found from VOCs of fresh tea leaves, and 19 of them were characterized, accounting for 94.405% of the total VOCs.The main chemical compounds were hexanoic acid, 3-hexenyl ester, ()-hexanoic acid-3-hexenyl ester (18.395%), leaf acetate (16.935%), ocimene (12.615%), and-3-hexenyl butyrate (11.210%).-3-hexenyl butyrate exhibited strong fumigation antifungal effect on the four tested fungal pathogens, and the EC50were lower than 61.29?μL·L-1.In conclusion,-3-hexenyl butyrate can be used as a potential fumigant control of tea diseases.

fresh tea leaves, fumigation, antifungal activity, VOCs,-3-hexenyl butyrate

S571.1；S482.292

A

1000-369X(2021)03-371-08

2020-06-08

2020-07-28

茶園化肥農藥減施增效技術集成研究與示范（2016YFD0200900）、信陽農林學院科技創新團隊項目（KJCXTD-201903）、河南省科技攻關項目（162102110085）

智亞楠，女，講師，主要從事植物源農藥與農藥劑型研究，zhiyanan000@126.com。*通信作者：chlijun1980@163.com

（責任編輯：趙鋒）