基于新型標記材料的免疫分析技術在真菌毒素檢測中應用的研究進展

胡高爽，吳天琪，蘇 丹，高娟娟，陳永媛，韓 雪，郝建雄，李 娜，郭 峰，高 山,

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050000；2.河北英茂生物科技有限公司，河北石家莊 050000；3.河北省食品質量與安全檢測技術創新中心，河北石家莊 051130）

真菌毒素（Mycotoxin）是由真菌產生的次級代謝產物，按化學結構來分，目前已知的真菌毒素有300 多種，其中具有代表性的有黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮毒素、伏馬毒素、赭曲霉毒素、嘔吐毒素等。真菌毒素不僅能夠導致食品腐敗變質、品質降低，而且給人類和動物帶來嚴重的健康風險，增加自身細胞出現癌變、畸形、突變的風險[1?2]。因此針對其開發簡單快速、靈敏可靠的檢測方法，具有重要的研究價值和現實意義。真菌毒素的檢測方法有很多種，其中，儀器分析法，包括液相色譜法（Liquid chromatography,LC）[3]、液相色譜法與質譜聯用方法（LC-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[4?5]、氣相色譜與質譜聯用法[6?7]等，因具有靈敏度高、測定結果準確可靠是目前最常用的真菌毒素檢測方法，但由于其需要使用大量的有機溶劑，需要昂貴的精密儀器，檢測成本高，檢測步驟冗長繁瑣且需要專業的操作人員，因而在現場快速篩查中的應用受到很大的限制。

免疫分析方法是一種基于抗體與抗原的特異性結合反應，是生物分析的重要手段之一，具有操作簡單、特異性好、靈敏度高等優點[8?9]，非常適合于大量樣品的現場快速檢測和篩選，在真菌毒素的快速檢測中應用廣泛。近年來，隨著納米科學的發展，一些新型標記材料的出現促進了免疫分析技術的進一步發展，本文針對基于新型標記材料的免疫分析技術應用于糧食產品中真菌毒素快速檢測的研究現狀進行綜述，以期為免疫分析技術在真菌毒素檢測的應用及發展提供參考。

1 酶聯免疫吸附法在真菌毒素檢測中的應用

酶聯免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是利用固相載體上的抗原（或抗體）能夠與待測樣品的抗原（或抗體）特異性結合，洗滌除去未與固相結合的其他物質，再加入能夠與抗原抗體結合的酶，此時待測物的量與固相上酶的量呈一定比例，最后加入底物，在酶催化的作用下底物顏色發生改變，通過測定底物的吸光度反映待測物量的多少，最終實現對目標物定性定量分析。Michalina 等[10]利用ELISA 方法實現了花生中黃曲霉毒素B1和總黃曲霉毒素的快速檢測，其針對黃曲霉毒素B1和總黃曲霉毒素的檢測限分別能夠達到0.4 μg/kg 和0.3 μg/kg。Zhang 等[11]建立了測定谷物中赭曲霉毒素A 含量的間接競爭ELISA 方法，檢測限能夠達到0.15 ng/mL，線性范圍為0.55～6.75 ng/mL。ELISA方法利用抗原抗體的特異性結合反應，具有靈敏好、特異性強等特點，但由于其采用酶蛋白作為標記物，需要復雜的樣品前處理步驟消除樣品中物質的干擾，因此，目前在真菌毒素檢測中的應用受到一定的限制，尋找抗基質干擾能力強的信號標記物成為目前酶聯免疫吸附法發展的趨勢。

近年來一些新型的納米標記材料越來越多的引起關注，越來越多的應用于真菌毒素的檢測中。Zhang 等[12]將碲化鎘量子點與黃曲霉毒素B1的單克隆抗體偶聯，建立了直接競爭熒光免疫吸附法（FLISA），該方法的檢測限為0.016 ng/mL，花生基質中樣品回收率能夠達到85%～117% 。Wu 等[13]以包被原修飾的磁性納米顆粒（MNPs）作為免疫傳感探針，以多色上轉換納米粒子（UCNPs）修飾的抗體作為熒光信號探針，建立了能夠測定玉米中黃曲霉毒素B1（AFB1）和赭曲霉毒素 A（ochratoxin A，OTA）2 種毒素的新型 FLISA。這種方法利用 UCNPs 多組分檢測的特性和 MNPs 的磁性分離效應，表現出靈敏度高（OTA 的檢測限均低至 0.01 μg/kg），檢測時間短等優點，可用于復雜基質中真菌毒素的快速檢測。Hu 等[14]利用發射波長為474 nm 的上轉換納米粒子，構建了磺胺喹惡啉上轉換標記-磁分離熒光免疫分析方法。該方法對磺胺喹惡啉的方法檢出限為0.1 μg/L，添加回收實驗得到磺胺喹惡啉的回收率良好，在69.8%～133.0%之間，且與商業化ELISA 試劑盒相比較，測定結果具有很好的一致性。

2 免疫層析技術在真菌毒素檢測中的應用

免疫層析方法是通過將特異性的抗原（或抗體）固定在硝酸纖維素膜等載體的某一區帶上，當樣品和標記探針混合物在層析作用下在膜上移動并流經該區帶時，樣品中相應的抗體（或抗原）與膜上對應的抗原（或抗體）發生特異性結合并富集，并在該區帶上顯示出探針標記物的信號，進而實現對目標物的定性定量分析。該技術由于操作步驟簡單、快速，成本低，在疾病快速診斷、食品安全檢測、環境污染監測等領域得到了廣泛的應用。

2.1 膠體金免疫層析技術

膠體金作為標記材料具有檢測結果可視化、制作簡單等優點，在免疫層析技術中應用廣泛。Hou 等[15]構建了基于25 nm 膠體金的復合免疫層析分析方法，并實現同時對小麥和玉米樣品中伏馬毒素B1（FB1）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）進行定性半定量檢測。在最優條件下，免疫層析試紙對FB1、DON 和ZEN 的可視化定量限分別為60、12.5 和6 ng/mL。然而膠體金作為信號標記材料具有成本高、易受環境污染、易受樣品基質干擾等缺點，因此在真菌毒素檢測中應用受到限制。

2.2 基于功能性納米粒子的免疫層析技術

近年來一些基于新型納米粒子的免疫層析技術受到越來越多的關注。納米粒子一般是指尺寸在1～100 nm 的超微粒子，具有比表面積大、表面穩定性高等特點。將其作為標記物代替傳統膠體金，可顯著提升現有免疫層析分析方法的靈敏度和穩定性。

2.2.1 基于納米微球的免疫層析技術 納米微球免疫層析技術是利用微球表面修飾羧基，進而可共價結合抗體，同時利用其穩定而強的顏色信號或熒光信號進行定量檢測的新型檢測技術。Liu 等[16]利用熒光微球作為信號探針并應用于免疫層析技術中實現醬油中黃曲霉毒素B1的快速檢測。該方法針對黃曲霉毒素B1的可視檢出限為2.5 μg/L，低于中國政府規定的最高5 μg/L。并且測定的結果與液相.色譜-質譜法（LC-MS）的結果一致。Zhang 等[17]建立了基于熒光微球的免疫層析技術，并成功應用于牛奶中黃曲霉毒素M1的快速檢測。在最佳條件下，該方法的IC50值為36.3 ng/L，樣品回收率為76.6%～110.8%，變異系數為4%～14.7%。結果表明，應用該方法檢測牛奶中AFM1殘留具有簡便、快速、靈敏度高、特異性強的特點。Li 等[18]構建了基于乳膠微球的免疫層析技術，并研制了基于智能手機的定量檢測裝置，最終實現了谷物和飼料中玉米赤霉烯酮（ZEN）的現場檢測，利用該系統針對谷物和飼料中ZEN 的檢測限分別為0.08 和0.18 μg/kg，該方法表現出穩定性好、靈敏度高、檢測方便快捷等優點，非常適合現場快速檢測。

2.2.2 基于量子點的免疫層析技術 量子點（Quantum dots，QDs）粒徑一般介于1～10 nm 之間，是一類由Ⅱ-Ⅵ族（如CdSe，CdTe，CdS，ZnSe 等）或Ⅲ-Ⅴ族（如InP，InAs 等）元素組成的納米顆粒。與傳統的熒光染料相比，它具有寬的紫外激發光譜和狹窄對稱的熒光發射光譜，量子產率高，光化學穩定性強，熒光壽命長，可接受多次激發等優越的熒光特性，因此，可以很好地應用于熒光標記。Hu 等[19?20]利用量子點與膠體金存在熒光淬滅的現象，構建了基于量子點的信號turn-on 模式的熒光猝滅免疫層析檢測方法，并成功應用于動物源性食品中喹諾酮和磺胺類獸藥的快速檢測。該設計方法操作簡便，檢測時間短，靈敏度高，可以為獸藥殘留快速檢測提供新思路。Hou 等[21]構建了基于量子點標記的熒光免疫層析法，并實現了谷物中的伏馬毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）同時定量檢測，針對FB1、DON 和ZEN 的IC50值分別為12.66、2.97、0.87 ng/mL。在構建針對小分子的免疫層析技術的過程中，直接標記抗體可能會影響抗體與靶抗原的結合性能。此外，化學合成半抗原偶聯物，特別是毒性半抗原，可能面臨操作復雜、批次間誤差大、環境污染等問題。Hu 等[22]利用量子點標記的鏈球菌蛋白G 作為通用熒光探針和生物合成模擬肽MBP 融合蛋白（F15-MBP）作為生物毒素包被原的替代物構建免疫層析方法，改善了以生物毒素直接制備半抗原存在污染環境、操作復雜等缺點，并實現了伏馬毒素B1的快速檢測，該方法表現出檢測靈敏度高，毒性小，環境友好等特點，可以作為真菌毒素檢測的有效方法。

2.2.3 基于普魯士藍納米粒子的免疫層析技術 普魯士藍（Prussian blue，PB）是一種古老的藍色染料，由 Fe2+和 Fe3+混合價態組合成的六氰合鐵酸鹽，其制備工藝簡單成本低，表面易修飾，且具有良好的光物理、電化學、電質變色和磁性等特點被應用于諸多領域。近年來，其在食品安全檢測方面的應用逐漸增多。Zhao 等[23]利用普魯士藍納米粒子作為標記材料構建了針對克侖特羅快速檢測的免疫層析試紙條，該方法針對克倫特羅的檢測靈敏度為1.0 ng/mL，是傳統膠體金免疫層析技術的5 倍。Tian 等[24]利用普魯士藍納米粒子介導信號的產生和級聯放大靈敏的免疫層析方法，并實現了針對赭曲霉毒素A（OTA）的快速檢測。當OTA 濃度為10 ng/mL 時，試紙條T 線上的顏色完全消失。普魯士藍作為一種新型的納米粒子在免疫層析技術中的應用有待進一步研究和開發。

2.2.4 基于上轉換納米粒子的免疫層析技術 上轉換納米粒子（UCNPs）是指受到光激發時能夠通過多光子機制發射比激發波長短的熒光納米材料[25?26]，其基本組成包括基質材料、激活劑和敏化劑，相較于傳統的有機染料作為生物標記材料，具有如下諸多優點[27,28]：光化學性質穩定性高；長波長激發短波長發射，背景干擾小，特別適合復雜生物樣本中的熒光標記。黃震等[29]利用上轉換納米材料，構建了牛奶中大腸桿菌O157:H7 的快速檢測的免疫層析方法，方法檢測限能夠達到2.8×104CFU/mL。該方法靈敏度較高，抗基質干擾能力強，不僅能用于大腸桿菌O157:H7 的檢測，也可被推廣應用于其它食源性致病菌檢測。Gong 等[30]開發了一個小型化、便攜化的基于上轉換納米粒子的免疫層析檢測（LFA）平臺，該平臺由免疫層析檢測系統、UCNP-LFA 讀數和智能手機輔助的UCNP-LFA 分析儀組成。LFA 檢測系統由三種發射波長UCNPs 構成，可以進行多路檢測。UCNP-LFA 讀數長寬高為24.0 cm×9.4 cm×5.4 cm（L×W×H）和重量為0.9 kg。該分析儀基于智能手機定制設計的軟件（稱為UCNP-LFA 分析儀），可以實時得到定量分析結果。通過對小分子赭曲霉毒素A（OTA)、重金屬離子（Hg2+）、細菌（沙門氏菌，SE）、核酸（乙肝病毒，HBV）和蛋白（生長刺激表達基因2，ST-2）的高靈敏度定量檢測，證明了該平臺的通用性。

2.2.5 基于磁性納米粒子的免疫層析技術 磁性納米粒子主要由磁性元素包括Fe，Ni，Co 以及它們的氧化物組成，具有比表面積大，可快速移動及生物相容性、超順磁性、單分散性好等特性，在磁場作用下可實現快速定位富集和分離[31]。Tang 等[32]以納米Fe2O3顆粒為核，金標納米顆粒為殼，制備了磁納米金微球（MnGMs），并構建了一種快速檢測食物中黃曲霉毒素 B2（AFB2）的免疫層析檢測方法。該方法針對AFB2檢出限為0.9 ng/mL，比傳統膠體金免疫層析試紙條靈敏度提高3 倍。Huang 等[33]利用納米磁珠富集和分離 AFM1，建立了快速檢測 AFM1的免疫層析方法，該方法針對牛奶中AFM1檢出限為0.1 ng/mL，且檢測結果和酶聯免疫吸附法檢測結果相一致，說明該方法非常適合牛奶中AFM1的快速檢測。劉坤等[34]采用聚乙烯亞胺-戊二醛介導體系制備了ZEN 免疫磁性微球，建立了高效富集捕獲飼料樣本中ZEN 的方法。結果表明該試紙條定量檢測時間為15 min，最低靈敏度為2.559 μg/L，且與ELISA 試劑盒有很好的相關性。此外，張博等[35]利用超聲乳化法成功制備多包裹磁納米球，將其作為信號標記物，構建了基于磁致熒光淬滅的雙模態聯檢免疫層析試紙條，并實現對血清及全血中生物標志物的高靈敏雙模態聯合檢測。結果表明，多包裹磁球熒光淬滅能力強，穩定性好，在對乳腺癌相關標志物CA153 和CEA 的聯合檢測中，靈敏度分別可達到0.06 ng/mL 和0.09 U/mL，該聯檢技術的應用能夠提高腫瘤和急性病癥的檢出率，降低成本和樣本用量，縮短檢測時間。目前，基于磁性納米粒子的免疫層析技術作為新興的標記層析技術已經引起了研究者的廣泛關注，是未來較好的研究方向。

3 電化學免疫傳感器在真菌毒素檢測中的應用

電化學免疫傳感器是一種結合電化學測定和免疫反應反應的分析器件，具有分析速度快、靈敏度高、特異性好、所需樣品量少、操作簡單、易于微型化等優點，在臨床診斷、食品分析及環境監測等領域具有重要的應用價值。Hou 等[36]開發一種超靈敏和綠色的檢測赭曲霉毒素A（OTA）的電化學免疫傳感器方法。該方法以OTA 噬菌體模擬肽代替傳統化學合成的競爭抗原，應用與競爭感應平臺上進行檢測。并用聚乙二醇（PEG）修飾工作電極固定化抗體。在優化的試驗條件下，建立的免疫傳感器的檢出限（LOD）為2.04×10?14g/mL，線性范圍為7.17×10?14～5.49×10?12g/mL。Enrique 等[37]構建了一種用于食品樣品中霉菌毒素殘留檢測的電化學免疫傳感器。該裝置使用電化學納米探針（CdSNP-AbDON）和抗原修飾的磁粒子（DON-BSAMP）檢測霉菌毒素，在小麥的檢測限量（LOD,IC90）為342.4 μg/L，低于歐盟規定的該霉菌毒素的最大殘留限量（MRL，未加工的硬粒小麥為1750 μg/L，直接供人類食用的谷物為750 μg/L）。Paniel 等[38]開發了一種基于磁性納米顆粒的電化學免疫傳感器并用于檢測牛奶中微量的黃曲霉毒素M1（AFM1）。該傳感器的樣品檢測限低至0.01 μg/L，且具有良好的重現性。

4 免疫芯片技術在真菌毒素檢測中的應用

免疫芯片技術是近年發展應用的一種高新技術。人工制成抗原或抗體與芯片結合，再將芯片與樣品一同反應，將反應信號數據實時上傳，從而實現定量檢測。免疫芯片準確度高，靈敏度好，過程全自動，但技術尚不成熟，仍需發展。Chen 等[39]基于微流體技術和蛋白芯片技術，建立了一套快速、靈敏的真菌毒素免疫檢測系統。利用一個定制包含流體控制系統和成像系統的微型裝置可以實現在30 min 內檢測四種真菌毒素的目的，表現出樣品用來體積小并且對用戶友好的特點。蔡婷婷等[40]利用多孔硅比表面積大，結合位點多的特點，以多孔硅為載體，結合免疫分析技術，建立一種蛋白質芯片技術來檢測谷物中的多元真菌毒素。方法對OTA 的檢測限為 32.6 pg/mL，AFB1的檢測限為0.314 ng/mL，FB1的檢測限為0.197 ng/mL。Li 等[41]提出了一種基于納米銀的可視化免疫微陣列方法，應用該方法可實現牛奶中的三聚氰胺、頭孢氨芐和黃曲霉毒素M1等多種靶標的同時檢測，其針對黃曲霉毒素M1的檢出限能夠達到0.21 ng/mL。

5 基于免疫分析的流式微球技術在真菌毒素檢測中的應用

流式微球技術是集懸浮芯片技術和流式細胞技術于一體的新型分析技術，具有靈敏度高、檢測速度快、組合靈活、反應動力學快的特點，將其與免疫分析技術相結合，在多殘留檢測領域具有很大的應用前景。Qu 等[42]選取黃曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬毒素B1等4 種霉菌毒素作為模型分析物，建立了針對牛奶中多種霉菌毒素檢測的流式微球技術，與傳統的ELISA 方法相比，所建立的方法具有更低的檢測限。然而，目前流式微球技術主要采用有機熒光染料和量子點制備編碼微球。這兩種材料都為下轉換熒光編碼材料，易受基質的影響，常伴有不同程度的背景熒光干擾，進而導致檢測靈敏度的下降。Zhang 等[43?44]利用上轉換熒光編碼磁性微球UCNPMMs 在免疫分析檢測領域進行了初步的探索，構建了針對黃曲霉毒素B1檢測的流式熒光免疫分析技術。因此，降低流式微球技術背景熒光干擾、簡化樣品前處理步驟成為目前流式微球技術用于實際樣品多殘留檢測中亟待解決的問題。

6 時間分辨熒光免疫分析技術在真菌毒素檢測中的應用

時間分辨熒光免疫分析技術是一種新型的超微量免疫標記分析方法，相較于酶標記免疫分析和放射免疫分析，其具有靈敏快速、操作簡便、線性范圍寬、無放射性、無背景光干擾等優點。Wang 等[45]利用Eu 納米粒子作為標記材料建立了一種基于時間分辨熒光的快速、靈敏的黃曲霉毒素B1的免疫層析定量檢測方法，結合時間分辨熒光傳感和免疫層析的優點，該方法針對黃曲霉毒素B1檢測限（LOD）為0.1 μg/kg，回收率為87.2%～114.3%。Tang 等[46]制備了增強熒光的Eu/Tb（III）納米球作為標記，并與抗個體基因型的納米體（AIdnb）和單克隆抗體（mAb）偶聯。在納米膜-抗體結合的基礎上，建立了兩種競爭性時間分辨條帶方法（AIdnb-TRFICA 和mAb-TRFICA），并進行了比較。AIdnb-TRFICA 對黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的半抑制濃度分別為0.46和0.86 ng/mL，比mAb-TRFICA 方法的靈敏度高18.3倍和20.3 倍。

7 展望

本文綜述了免疫分析技術在真菌毒素檢測中應用的現狀，如表1 所示。目前，免疫分析技術因其簡便，快速，靈敏及經濟等優點而被越來越多地應用于大量樣品的快速檢測，顯示出其巨大的發展潛力和廣闊的應用前景。但是，該技術應用于真菌毒素快速分析領域仍存在一些需要深入研究和開發的問題:現有研究表明[47]，同一樣品中多種真菌毒素共同存在的可能性極大，多毒素間協同作用可增強毒素的體內毒性作用。因此，建立同時檢測多種真菌毒素的快速、靈敏、準確檢測方法有重要的現實意義；免疫分析檢測法需要將真菌毒素偶聯蛋白作為包被抗原，制備過程困難且存在對環境和人員有毒有害、價格昂貴等問題。因此，尋找抗原替代品，實現“綠色化”檢測真菌毒素迫在眉睫。近來通過噬菌體展示技術制備模擬表位肽取代抗原，表現出制備成本低，抗體效能好，是未來真正實現無毒無害檢測非常重要的研究方向[48?49]；免疫分析法需要制備特異性抗體，而抗體制備需要動物免疫等步驟制備成本高，時間長，受免疫原性限制且無法分離交叉反應的物質。相比抗體，適配體作為一種可體外化學合成、結構穩定、具有高親和性和特異性的“化學抗體”，完善了免疫分析檢測出現的不足[50]，是未來的發展方向。

表1 基于不同標記物的免疫分析技術在真菌毒素檢測中的應用Table 1 Application of different labeling materials-based immunoassay in mycotoxins detection