血流感染細菌快速鑒定及藥敏試驗的方法學評價

丁毅偉，吳思敏，韓志海*

1解放軍總醫院第六醫學中心呼吸與危重癥醫學科，北京 100048；2海南省腫瘤醫院病理科，海口 570312

血流感染是一種嚴重的全身感染性疾病，發病率較高，可導致機體多器官功能障礙，嚴重者發生休克甚至死亡[1]。血流感染患者的預后與有效的抗生素治療起始時間有關，若在感染初期開始治療，存活率為79.9%，每推遲1h存活率將降低7.6%[2]；而由于缺乏快速的細菌鑒定和藥物敏感性信息，臨床醫師常采取經驗性廣譜抗生素治療，若藥物選擇不恰當，會降低生存率乃至出現較高的病死率[3]。因此，快速檢測血流感染中的病原菌(如細菌和真菌等)以降低微生物的抗藥性，以及為臨床提供快速和準確的抗菌藥物敏感性試驗結果，是臨床微生物實驗室需要解決的重要問題[4-5]。本研究對血培養陽性標本行MALDI-TOF MS鑒定和VITEK 2 Compact藥敏試驗，比較快速直接檢測方法(簡稱快速法)與傳統檢測方法(簡稱傳統法)的一致性及準確性，以期對血流感染病原體快速鑒定及藥敏試驗的方法學做出評價。

1 材料與方法

1.1 標本及其來源 采集2019－2020年解放軍總醫院第六醫學中心門急診及住院患者的血流感染標本，按照《臨床微生物實驗室血培養操作規范衛生行業標準(WS/T503-2017)》進行血培養采集標準操作，送至檢驗科，置于血培養儀中培養，待血培養報警后收集陽性標本。

1.2 主要試劑及儀器 血瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基(鄭州安圖生物工程股份有限公司)；HB&L微生物培養儀(意大利Alifax HB&L公司)；基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF MS)(美國Bruker-Daltonik公司)；VITEK 2 Compact型全自動微生物鑒定和藥敏系統(法國梅里埃公司)。

1.3 快速法與傳統法鑒定試驗

1.3.1 快速法鑒定試驗 取2 ml血培養陽性標本置于1.5 ml無菌EP管中，然后從EP管中取10 μl菌液轉種于2 ml HB&L細菌分析儀培養液瓶中，置于HB&L微生物培養儀中進行繼代培養，當菌液濃度達到

1.5麥氏濃度后，取1 ml陽性菌液置于1.5 ml無菌EP管中，13 000 r/min離心3 min，制備沉淀物。平行制備2份沉淀物，利用MALDI-TOF MS鑒定細菌。

1.3.2 傳統法鑒定試驗 將收集的血培養陽性標本進行傳統法培養，接種于血平板培養基、麥康凱培養基，35 ℃培養24 h后，挑取單個菌落，利用MALDI-TOF MS鑒定細菌。

1.4 快速法與傳統法藥敏試驗

1.4.1 快速法藥敏試驗 當上述陽性菌液濃度達到1.5麥氏濃度后，取1 ml置于1.5 ml無菌EP管中，13 000 r/min離心2 min，制備沉淀物。平行制備2份沉淀物，利用VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統進行藥敏試驗。

1.4.2 傳統法藥敏試驗 選擇培養皿上的待測菌落，利用VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統進行藥敏試驗；如需K-B藥敏試驗，參照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)標準進行。快速法與傳統法藥敏試驗判斷折點均參照CLSI M100-S29文件。

1.5 快速法與傳統法鑒定試驗和藥敏試驗結果判讀標準 MALDI-TOF MS細菌鑒定結果判讀：鑒定得分≥2.000分表示準確鑒定到種，1.700～1.999分表示準確鑒定到屬，<1.700分表示鑒定結果不可靠。參照ISO20776-2文件判斷快速法與傳統法藥敏試驗結果的符合率和錯誤率，當比對結果完全滿足可接受標準時，則為可接受(表1)。

表1 快速法與傳統法藥敏試驗結果判斷標準Tab.1 Judgment criteria for the results of drug sensitivity test of rapid method and traditional method

1.6 統計學處理 采用Whonet 5.6及Excel軟件進行統計分析。計數資料以率(%)表示。

2 結 果

2.1 快速法與傳統法鑒定結果一致率分析 共收集血培養陽性標本149例。如表2所示，傳統法鑒定出革蘭陽性球菌79株、革蘭陰性桿菌70株。快速法與傳統法鑒定相符的革蘭陽性球菌75株、革蘭陰性桿菌67株。兩種方法鑒定的一致率為95.3%(142/149)，鑒定革蘭陽性球菌、革蘭陰性桿菌的一致率分別為94.9%(75/79)、95.7%(67/709)。

表2 血培養陽性標本快速法與傳統法鑒定一致率分析Tab.2 Analysis of the consistency rate of rapid method and traditional method in identification of positive blood culture specimen

2.2 快速法與傳統法鑒定革蘭陽性球菌的準確性分析 如表3所示，149例血培養陽性標本中，傳統法鑒定出革蘭陽性球菌79株，其中76株(包括2.300～3.000分16株、2.000～2.299分60株)鑒定到種，占96.2%(76/79)；3株鑒定到屬，占3.8%(3/79)。快速法鑒定出革蘭陽性球菌75株，其中52株(包括2.300～3.000分10株、2.000～2.299分42株)鑒定到種，占69.3%(52/75)；20株鑒定到屬，占26.7%(20/75)；3株鑒定結果不可靠，占

表3 快速法與傳統法鑒定革蘭陽性球菌的準確性分析[株(%)]Tab.3 Accuracy analysis of rapid method and traditional method in identification of Gram-positive cocci [n(%)]

4.0%(3/75)。

2.3 快速法與傳統法鑒定革蘭陰性桿菌的準確性分析 如表4所示，149例血培養陽性標本中，傳統法鑒定出革蘭陰性桿菌70株，其中66株(包括2.300～3.000分29株、2.000～2.999分37株)鑒定到種，占94.3%(66/70)；4株鑒定到屬，占5.7%(4/70)。快速法鑒定出革蘭陰性桿菌67株，其中63株(包括2.300～3.000分30株、2.000～2.999分33株)鑒定到種，占94.0%(63/67)；3株鑒定到屬，占4.5%(3/67)；1株鑒定結果不可靠，占1.5%(1/67)。2.4 革蘭陽性球菌快速法與傳統法藥敏試驗結果的符合率和錯誤率分析 傳統法共分離出79株革蘭陽性球菌，按照葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌藥敏試驗結果符合率統計，環丙沙星、莫西沙星、呋喃妥因、利福平4種藥物的一般錯誤率均≤10.0%。氯林霉素、四環素、復方新諾明出現嚴重錯誤，其中氯林霉素、四環素嚴重錯誤率均<3.0%，復方新諾明嚴重錯誤率為3.1%。誘導性克林霉素出現極嚴重錯誤，極嚴重錯誤率為1.5%(表5)。

表4 快速法與傳統法鑒定革蘭陰性桿菌的準確性分析[株(%)]Tab.4 Accuracy analysis of rapid method and traditional method in identification of Gram-negative bacilli [n(%)]

表5 革蘭陽性球菌快速法與傳統法藥敏試驗結果的符合率和錯誤率分析[株(%)]Tab.5 Analysis of coincidence rate and error rate of rapid method and traditional method in drug sensitivity test of Grampositive cocci [n(%)]

2.5 革蘭陰性桿菌快速法與傳統法藥敏試驗結果的符合率和錯誤率分析 傳統法共分離出70株革蘭陰性桿菌，根據革蘭陰性桿菌藥物藥敏試驗結果符合率統計，氨芐青霉素/舒巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、米諾環素、替加環素、美羅培南、阿米卡星、環丙沙星、左氧氟沙星的一般錯誤率均≤10%，未出現嚴重錯誤和極嚴重錯誤，所有藥物均符合快速法和傳統法的藥敏試驗結果判斷標準(表6)。

表6 革蘭陰性桿菌快速法與傳統法藥敏試驗結果的符合率和錯誤率分析[株(%)]Tab.6 Analysis of coincidence rate and error rate of rapid method and traditional method in drug sensitivity test of Gramnegative bacilli [n(%)]

3 討 論

血流感染引起的膿毒癥是住院患者尤其是重癥監護室患者死亡的主要原因之一[6-7]。血培養是診斷血流感染的“金標準”，也是血流感染不可替代的確診試驗方法。近年來，細菌的多重耐藥有上升趨勢[8-10]，且僅少數新開發的抗生素被納入臨床治療中[11-12]。因此，血培養陽性樣品的快速鑒定和藥敏試驗尤為重要。

本研究結果顯示，快速法與傳統法鑒定的一致率為95.3%，鑒定革蘭陽性球菌、革蘭陰性桿菌的一致率分別為94.9%和95.7%，均高于血清分離膠法MALDI-TOF MS直接鑒定，如馬堅等[13]的研究中革蘭陽性球菌和革蘭陰性桿菌的鑒定一致率分別為64.1%和35.9%，而李聰等[14]的研究中分別為52.9%和88.4%，Gu等[15]的研究中分別為71.0%和74.0%，分析其原因可能為快速法僅吸取10 μl樣本，可減少血培養液中血液細胞、纖維等成分的干擾。本研究發現，快速法與傳統法鑒定腸桿菌科具有很好的一致性，其中肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、產氣腸桿菌、黏質沙雷菌、陰溝腸桿菌能夠全部被鑒定出，但1株銅綠假單胞菌和2株洋蔥伯克霍爾德菌等革蘭陰性桿菌未鑒定出，金黃色葡萄球菌、頭葡萄球菌、科氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌等革蘭陽性球菌各1株未鑒定出。分析其原因可能是由于非發酵菌代謝較慢，獲取的菌液沉淀不足以達到MALDITOF MS分析的閾值，從而影響了鑒定結果，后期應加大樣本量進一步分析。

本研究采用MALDI-TOF MS鑒定病原菌，共分為2.300～3.000、2.000～2.299、1.700～1.999、<1.700 4個分值段，一般認為分值≥2.000分為鑒定到種，1.700～1.999分為鑒定到屬，<1.700分為鑒定結果不可靠。快速法鑒定革蘭陽性球菌≥1.700分72株，占91.1%(72/79)，鑒定革蘭陰性桿菌≥1.700分66株，占94.3%(66/70)，菌屬鑒定率達90.0%以上。傳統法與快速法鑒定的分值主要集中在2.000～2.299分，其中傳統法鑒定出的革蘭陽性球菌占75.9%(60/79)，快速法鑒定出的革蘭陽性球菌占56.0%(42/75)，且快速法鑒定分值在2.3 0 0 ～3.0 0 0 分占比達13.3%(10/75)。本研究還發現，傳統法未見鑒定分值<1.700分的菌株，但快速法中革蘭陽性球菌鑒定分值<1.700分占4.0%(3/75)，革蘭陰性球菌鑒定分值<1.700分占1.5%(1/67)。有學者建議在不影響準確性的情況下，鑒定分值最低可降至1.4分[16-18]。因此，快速法可快速獲得細菌鑒定結果，直接為臨床醫師提供參考意見，必要時可針對目標菌經驗用藥，盡早為患者提供有效治療。

目前，傳統法血培養報陽后，進行細菌藥物敏感試驗用時長，通常需要48～72 h才可獲得準確結果，難以滿足臨床及時獲取感染病原菌及其藥敏試驗結果的需求。而快速法可縮短藥敏試驗時間，且能提供準確的藥敏試驗結果。本研究發現，革蘭陰性桿菌藥敏試驗中，美羅培南、環丙沙星、左氧氟沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、替加環素、阿米卡星、氨芐西林/舒巴坦、米諾環素的藥敏結果標準符合率≥90%、一般錯誤率≤10%，未出現嚴重錯誤和極嚴重錯誤；革蘭陽性球菌藥敏試驗中，氯林霉素、四環素出現嚴重錯誤，誘導性克林霉素出現極嚴重錯誤，但均符合標準，值得注意的是復方新諾明藥敏結果出現嚴重錯誤，嚴重錯誤率為3.1%，超出標準，后期應加大樣本量進一步分析原因。該結果與Barnini等[17]的研究一致：革蘭陰性桿菌和革蘭陽性球菌在所有藥物檢測中的準確性可達90%以上。本研究采用HB&L微生物培養儀聯合MALDI-TOF MS及VITEK 2 Compact儀器進行細菌鑒定和藥敏試驗，可有效縮短菌株鑒定及藥敏試驗的時間，且能達到一定的準確性。值得注意的是，本研究對于鑒定時間未進行具體分析，且測試的菌株數量較少，后續仍需收集更多臨床標本進一步評估。

綜上所述，本研究采用HB&L微生物培養儀對快速培養陽性標本行直接鑒定和藥敏試驗，突破傳統培養后應用單個菌落進行菌種鑒定和藥敏試驗的局限，避免了血培養陽性標本血液直接鑒定時血細胞引起的干擾，且可節省約24 h的培養時間，縮短了檢測周轉時間，具有一定的技術創新性，可為臨床血流感染的及時診斷和治療提供實驗室依據，具有較高的臨床應用價值。該方法可幫助臨床醫師及時明確血流感染的病原菌，使醫師從經驗性使用廣譜抗菌藥物快速轉變為有針對性的靶向治療，降低了藥物毒性、耐藥性和醫療成本，從而提高臨床抗感染治療的效果。