吉林地區奶牛子宮內膜炎致病菌的分離鑒定及敏感藥物篩選

郝景鋒，李高謙，張宇航，王永生，付連軍，劉立明

(1.吉林農業科技學院動物科技學院，吉林 吉林 132101 ； 2. 阿勒泰職業技術學院，新疆 阿勒泰 836000 ; 3.吉林農業大學研究生學院，吉林 長春 132118)

奶牛子宮內膜炎是子宮黏膜表面及深層組織發生的炎性疾病[1]，是奶牛常見病、多發性疾病，對奶牛健康養殖危害巨大，不僅影響奶牛正常的生理功能，還會導致奶牛長期不孕，甚至造成終生不育而提早淘汰[2]，其與奶牛乳房炎、蹄葉炎并列成為制約奶牛養殖業發展的瓶頸問題。奶牛子宮內膜炎治療產生大量費用，易產生耐藥性，導致藥物殘留影響牛奶、牛肉等動物性食品安全[3]，我國奶牛存欄量1 440萬頭[4]，吉林地區奶牛養殖量較大，奶牛子宮內膜炎防控問題較為突出，本課題組擬對吉林地區多個大型奶牛場120頭患病奶牛子宮內容物進行細菌分離與鑒定，并對其主要致病菌進行敏感藥物篩選試驗，以期為科學、合理治療吉林地區奶牛子宮內膜炎提供一定的技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗對象 患病奶牛選自吉林地區多個奶牛養殖場120頭患子宮內膜炎奶牛，采用子宮內容物采樣器(專利號:ZL201420335941.6)無菌采集子宮內容物。

1.2 試驗器材與試劑

1.2.1 常規培養基 普通營養瓊脂培養基、伊紅美藍瓊脂培養基、綿羊血液(50 mL/L綿羊鮮血)瓊脂培養基、甘露醇高鹽瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、疊氮鈉血培養基、營養肉湯，以上各培養基采用常規方法配制。

1.2.2 細菌鑒定生化管 生化鑒定用微量發酵管，購自上海魯微科技有限公司。

1.2.3 藥敏紙片 頭孢噻呋鈉、頭孢噻肟、呱拉西林、慶大霉素、環丙沙星、青霉素G、氨芐西林、頭孢西汀、鏈霉素、卡那霉素、四環素、復方新諾明、克林霉素、阿莫西林、氟哌酸、恩諾沙星、強力霉素、卡拉霉素、氧氟沙星等藥敏紙片，均購自杭州微生物制劑有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養基制備 參照《獸醫微生物學》第5版[5]教材進行。

1.3.2 樣品采集 奶牛子宮內膜炎患牛子宮內容物樣品120份，采自吉林地區多個大型奶牛場。患牛保定后清理宿糞，以1%新潔爾滅溶液清洗外陰部[6]，采用直腸把握法向子宮內插入子宮內容物采樣器采集子宮內分泌物黏液，注入無菌處理的離心管內并編號，置于冰盒中送至實驗室待檢。

1.3.3 細菌分離純化培養 生理鹽水稀釋子宮內容物[7]，將稀釋好的病料分別接種于普通營養瓊脂培養基、伊紅美藍瓊脂培養基、綿羊血液(50 mL/L綿羊鮮血)瓊脂培養基、甘露醇高鹽瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、疊氮鈉血培養基等各種培養基內，置于37 ℃溫箱內過夜，培養24 h，取出觀察，根據菌落形態、是否溶血以及顏色特點分類純培養，純化后置于20%甘油的營養肉湯培養基于-80 ℃冰箱保存待用。

1.3.4 細菌鑒定 應用生化方法分類鑒定已純化處理的待檢致病菌，應用V-P、MR、觸酶、凝固酶、麥芽糖氧化酶、尿素、甘露醇、葡萄糖、堿性磷酸酶、明膠液化等生化方法鑒定疑似葡萄球菌科致病菌；應用吲哚、甲基紅、V-P、枸櫞酸、乳糖、麥芽糖、蔗糖、尿素、間肌醇、蕈糖等生化方法鑒定疑似腸桿菌科致病菌；應用觸酶、6.5%氯化鈉、馬尿酸鈉、環腺苷-磷酸(CAMP)、甘露醇、棉子糖、山梨醇、七葉苷、乳糖、葡萄糖、水楊苷蕈糖、菊糖、淀粉等生化方法鑒定疑似鏈球菌屬致病菌。

1.3.5 敏感藥物篩選 藥敏試驗采用紙片瓊脂擴散法[8]，選用頭孢噻呋鈉、慶大霉素、環丙沙星、青霉素G、氨芐西林、阿莫西林等藥敏紙片，接種各已檢致病菌于37 ℃溫箱培養24 h后觀察試驗結果，測定抑菌圈平均直徑，抑菌效果判定：敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)，參考美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)推薦的標準。

1.4 數據處理 數據結果采用5次試驗的平均值±標準誤表示。

2 結果

2.1 樣品中致病菌分離及鑒定 從120份奶牛子宮內容物樣品中分離出211株細菌，包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化膿鏈球菌、綠膿桿菌、蠟樣芽胞桿菌以及化膿放線菌等。結果見表1，大腸桿菌68株，占32.23%；金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌分別為26、14株，各占12.32%、6.64%；化膿鏈球菌49株，占23.22%；蠟樣芽胞桿菌37株，占17.54%；綠膿桿菌10株，占4.74%；化膿放線菌7株，占3.32%。可見大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌以及蠟樣芽胞桿菌為吉林地區奶牛子宮內膜炎主要致病菌，從感染類型上來看，單一感染占44.35%；雙重致病菌感染占41.74%；三重致病菌感染占13.91%。單一感染中大腸桿菌以及蠟樣芽胞桿菌為主要致病菌；雙重感染中大腸桿菌與化膿鏈球菌為主要致病菌；三重感染中大腸桿菌+金黃色葡萄球菌+蠟樣芽胞桿菌以及大腸桿菌+表皮葡萄球菌+ 化膿鏈球菌均為優勢致病菌，結果見表2。

表1 吉林地區奶牛子宮內膜炎致病菌檢測結果Table 1 Detection results of pathogenic bacteria of dairy cow endometritis in Jilin area

表2 吉林地區奶牛子宮內膜炎致病菌感染類型檢測結果Table 2 Detection results of pathogenic bacteria infection types of dairy cow endometritis in Jilin area

2.2 敏感藥物篩選試驗 選用頭孢噻呋鈉、四環素以及恩諾沙星等19種藥物對檢測出的大腸桿菌等5種主要致病菌進行敏感藥物篩選試驗，結果見表3，由表3可知，各種致病菌對頭孢噻呋鈉、頭孢噻肟、呱拉西林素、頭孢西汀、鏈霉素以及卡那霉素均產生較強的耐藥性；而四環素、環丙沙星、慶大霉素、恩諾沙星以及氧氟沙星等對各種致病菌均有較強的抑菌作用，因此治療吉林地區奶牛子宮內膜炎的優選藥物為四環素、環丙沙星、慶大霉素、恩諾沙星以及氧氟沙星等。

表3 不同藥物對各種致病菌的平均抑菌直徑Table 3 Average bacteriostatic diameter of different drugs to various pathogenic bacteria (mm)

3 討論

本試驗檢測了來自吉林地區不同規模的奶牛養殖場120頭奶牛，經形態學、生化鑒定分離出大腸桿菌以及蠟樣芽胞桿菌等7種致病菌，共計211株致病菌，其中大腸桿菌所占32.23%，化膿鏈球菌所占23.22%，葡萄球菌所占18.96%，蠟樣芽胞桿菌所占17.54%，感染類型中單一感染占44.35%，雙重感染占41.74%。黃啟震等[9]通過研究證實，赤峰、重慶、張家口以及濰坊等地奶牛子宮內膜炎的主要致病菌依次為葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌以及鏈球菌；而寶雞地區奶牛子宮內膜炎的主要致病菌為葡萄球菌；北京奶牛子宮內膜炎主要致病菌為蠟樣芽孢桿菌。王京仁等[10]研究發現，常德地區奶牛子宮內膜炎致病菌病例25頭患牛主要菌株的檢出率依次為大腸桿菌11株(44.00%)、葡萄球菌屬7株(28.00%)、鏈球菌5株(20.00%)。劉長彬等[11]研究證實，來自石河子墾區206份樣品中分離出8種病原菌共408株，其中葡萄球菌198株(占48.53%)、鏈球菌109株(占25.49%)、大腸桿菌85株 (占20.83%)。趙清梅等[12]調查了寧夏地區奶牛子宮內膜炎主要病原菌，研究證實單一感染與混合感染分別各占42.31%以及52.56%。以上研究均與本試驗趨勢一致，亦證實了奶牛子宮內膜炎的主要致病菌為大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌以及蠟樣芽胞桿菌，所占比例基本一致，大腸桿菌等致病菌均為環境常見菌，證實環境因素為奶牛子宮內膜炎發生的重要因素，飼養管理水平、環境消毒能力、奶牛產科疾病治療水平、免疫水平等因素均與奶牛子宮內膜炎發病關系密切。

辛萍萍等[13]對濰坊地區奶牛子宮內膜炎致病菌進行藥敏試驗證實，頭孢拉定、環丙沙星、恩諾沙星抗菌效果良好，這與本試驗結果十分接近。趙鑫[14]研究證實，大腸桿菌對阿莫西林、恩諾沙星、頭孢噻肟敏感，葡萄球菌對阿莫西林、頭孢噻肟、四環素較敏感，鏈球菌對阿莫西林、頭孢噻肟、恩諾沙星敏感，這與本試驗藥物敏感趨勢一致。青霉素G、頭孢噻呋鈉、頭孢西汀、鏈霉素、卡那霉素以及呱拉西林這幾種藥物對大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌以及蠟樣芽胞桿菌抑菌效果均不好，可能與長期使用該藥而產生的耐藥性有關，也可能與季節、環境等因素有關，大量使用這些藥物使機體產生抗藥性，不科學的治療會使該病治療形成惡性循環，無法根治。而且化學藥物殘留嚴重影響乳以及肉的品質，食品安全受到前所未有的挑戰，嚴重危害人類健康。孟彥軍[15]研究證實，引起隴西縣奶牛子宮內膜炎的主要致病菌大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌對氨芐青霉素、鏈霉素、青霉素G等藥物具有耐藥性，試驗證實，恩諾沙星、環丙沙星以及四環素對以上致病菌抑菌效果良好，可以作為治療首選藥物。大量研究證實，抗生素在治療奶牛子宮內膜炎中發揮了重要作用，但一定要注意耐藥性問題、藥物殘留問題、動物性食品安全問題等，因此較為有效的方法是科學有效分離致病菌，篩選敏感藥物科學治療乃為上策。本試驗成功分離出吉林地區奶牛子宮內膜炎主要致病菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鏈球菌以及蠟樣芽胞桿菌，單一感染、雙重感染所占比例分別為44.35%以及41.74%，三重感染所占比例為13.91%；通過敏感藥物篩選頭孢噻肟、慶大霉素、環丙沙星、四環素、阿莫西林、恩諾沙星以及氧氟沙星均顯示出較好的抑菌效果，可以作為吉林地區奶牛子宮內膜炎治療的備選藥物。