沙門菌和大腸桿菌噬菌體對試驗感染小鼠的保護作用

徐鳳宇，朱振宇，蔣依倩，張喜慶，馬紅霞，高云航，么乃全

(1. 吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118 ；2. 動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，吉林 長春 130118)

沙門菌、大腸桿菌是引起動物敗血癥和腸炎等疾病的重要病原，間或引起食物中毒[1-2]，可在不同動物間傳播[3]。隨著養殖業的發展及抗生素的不合理使用，耐藥菌株不斷被分離并呈蔓延趨勢[4]，使細菌病的防治愈發困難，探尋治療耐藥菌感染的新型安全有效抗菌劑成為基礎與臨床醫學研究的結合點。以細菌為天然宿主的噬菌體具有很好的殺菌能力，并能特異性殺死宿主菌而不破壞正常菌群，成為治療多重耐藥菌感染的新希望[5-7]。

本試驗應用前期分離的多重耐藥沙門菌噬菌體SP3383和大腸桿菌噬菌體EP-SY[8-9]，分別進行預防和治療宿主菌CVCC3383株或SY株感染小鼠試驗，評價噬菌體對耐藥菌感染的防治效果，為更深入探索噬菌體在臨床中的應用提供資料。

1 材料與方法

1.1 菌株 沙門菌噬菌體SP3383和大腸桿菌噬菌體EP-SY由本實驗室分離并保存。宿主菌豬霍亂沙門菌CVCC3383株，由吉林農業大學預防獸醫實驗室老師饋贈，本實驗室保存；大腸桿菌SY株由本實驗室分離并保存。

1.2 主要試劑與儀器 96孔細胞培養板、石蠟，均購自長春華益生物科技有限責任公司；蘇木素-伊紅染液，購自南京建成生物有限公司；黏附載玻片、蓋玻片，均購自江蘇世泰實驗器材有限公司。酶標儀(15644)為上海京工實業有限公司生產；手動旋轉式石蠟切片機(CUT4062)為德國SLEE醫療器械有限公司生產；倒置顯微鏡(IX71-A21PH)由奧林巴斯中國有限公司生產；生物組織攤烤片機(YT-7FB)為湖北省孝感市亞光醫用電子技術公司生產。

1.3 實驗動物 2～3周齡、體重10～15 g、健康離乳昆明小鼠110只，購自北京華阜康生物有限公司，預飼7 d。

1.4 方法

1.4.1 噬菌體體外殺菌活性檢測 制備合適濃度的宿主菌與噬菌體液。取96孔細胞培養板，向各孔中分別加入稀釋的噬菌體液與宿主菌液各100 μL，使其達到最佳感染復數(SP3383、EP-SY分別為0.1、0.01)比例，輕微振蕩混勻，置37 ℃下培養；每隔1 h，從左至右依次加入相應的100 μL噬菌體液與100 μL宿主菌液，繼續培養；12 h后用酶標儀測各孔吸光度。對照組為100 μL宿主菌液與100 μL 儲存介質(Storage media，SM)液。

1.4.2 噬菌體對細菌感染小鼠的預防與治療作用

1.4.2.1 噬菌體安全性檢測 (1)無菌檢測：取制備的噬菌體液100 μL，均勻涂布于LB平板上，37 ℃ 恒溫培養24 h，觀察平板上菌落生長情況。(2)噬菌體對小鼠的毒性：將預飼的健康離乳小鼠30只隨機平分為3組，雌雄各半。第1組小鼠腹腔注射劑量為1012PFU/只的EP-SY噬菌體液；第2組小鼠注射同量的SP3383噬菌體液；第3組小鼠注射生理鹽水。3個組小鼠同條件飼養，觀察記錄臨床表現，7 d后撲殺剖檢，檢查各器官病變。

1.4.2.2 試驗分組 將健康離乳昆明小鼠80只隨機平分為8組。按姚營等[10]方法，在小鼠飲水中加入鏈霉素(5 mg/mL)預處理1 d，正常飼養1 d，禁食6 h后灌胃接種。感染組小鼠僅灌服接種2×1012CFU/只宿主菌液；預防組小鼠先灌服2×1011PFU/只 SP3383液或2×1010PFU/只EP-SY液，2 h 后再分別灌服2×1012CFU/只相應宿主菌液；治療組小鼠先灌服宿主菌液，2 h后再灌服噬菌體液；對照組灌服滅菌生理鹽水。

1.4.2.3 腸道組織病理切片的制作與觀察 灌胃接種48 h后，將小鼠脫頸，觀察各組小鼠十二指腸、空腸、腸系膜淋巴結病變，置于10%甲醛中固定，制作石蠟切片并進行H.E.染色，顯微鏡下觀察各組小鼠的病理組織學變化。

1.4.2.4 脾臟和腸道組織活菌計數 無菌操作取1.4.2.3中處死小鼠的脾臟和腸道組織(大腸桿菌試驗組取十二指腸，沙門菌試驗組取空腸)，加入等量生理鹽水研磨成勻漿。對勻漿液作10倍梯度稀釋，取適宜稀釋度100 μL涂布于含有Amp和Kan的麥康凱瓊脂培養基或SS瓊脂培養基表面，干燥，置37 ℃恒溫培養16 h計數菌落。

2 結果

2.1 噬菌體體外殺菌活性 以時間為橫坐標，以OD680為縱坐標，繪制噬菌體殺菌活性曲線(圖1)。在初始7 h內，在噬菌體SP3383作用下，CVCC3383的濁度逐漸降低，此后，盡管細菌濁度升高，吸光度仍較未處理組低0.3以上；在初始5 h內EP-SY殺菌組吸光度基本保持不變且較低，SY株的吸光度隨時間延長呈持續上升趨勢；5 h后EP-SY組濁度慢慢升高，但較SY組仍低約0.3。說明噬菌體SP3383、EP-SY在共培養前期對宿主菌具一定殺滅作用。

圖1 噬菌體SP3383、EP-SY殺菌活性Fig.1 Bactericidal activity of phage SP3383 and EP-SY

2.2 噬菌體安全性檢測 將涂有SP3383或EP-SY噬菌體液的平板培養24 h后，均未見菌落生長，說明噬菌體液無雜菌污染。小鼠腹腔注射EP-SY或SP3383噬菌體液7 d內，生長狀況良好，未出現精神不振、食欲減退、糞便異常等現象，剖檢未見組織器官出現病理變化，說明噬菌體EP-SY、SP3383對實驗小鼠安全。

2.3 腸道組織病理學檢測 沙門菌感染組小鼠肉眼可見空腸腫脹、出血，腸系膜淋巴結腫大、充血，其余各組無明顯病變。顯微鏡下觀察病理切片可見感染組小鼠空腸絨毛刷狀緣部分破裂，杯狀細胞增多(封三彩版圖2A)，預防組、治療組小鼠腸道組織結構正常，絨毛刷狀緣完整，與對照組基本一致(封三彩版圖2B～2D)。

圖2 光學顯微鏡觀察小鼠空腸組織學變化 (H.E.染色，200×)Fig.2 Histological changes of jejunum in mice observed by light microscope (H.E.staining,200 ×)A：感染組； B：預防組； C：治療組； D：對照組A:Infection group; B:Prevention group; C:Treatment group; D:Control group

圖3 光學顯微鏡觀察小鼠十二指腸組織學變化 (H.E.染色，200×)Fig.3 Histological changes of duodenum in mice observed by light microscope (H.E.staining,200×)A：感染組； B：預防組； C：治療組； D：對照組A:Infection group; B:Prevention group; C:Treatment group; D:Control group

大腸桿菌感染組小鼠肉眼可見十二指腸腸壁變薄、充滿氣體，腸系膜淋巴結腫大，其余各組無明顯病變。鏡下可見小鼠十二指腸絨毛部分斷裂，固有層與腸上皮細胞分離(封三彩版圖3A)，預防組、治療組小鼠腸絨毛排列整齊，與對照組相近(封三彩版圖3B～3D)。

2.4 脾臟和腸道組織活菌計數 沙門菌組灌胃接種48 h后，取小鼠脾臟和空腸，用SS瓊脂培養基活菌計數。結果如圖4所示，對照組脾臟及空腸勻漿中幾乎無宿主菌生長；預防組(6.2×102CFU/g，4.2×104CFU/g)、治療組(3.9×102CFU/g，1.2×105CFU/g)的脾臟及空腸勻漿中宿主菌數量較感染組(2.4×104CFU/g，6.7×107CFU/g)低，且差異顯著(P<0.05)。說明噬菌體SP3383對耐藥沙門菌CVCC3383株引起的小鼠感染有一定預防和治療作用。

圖4 小鼠脾臟和空腸的沙門菌CVCC3383株活菌計數結果Fig.4 Counting results of Salmonella CVCC3383 strain of mice spleens and intestine 注：與感染組比較，*：P<0.05；下圖同Note: Compare to infection group,*：P<0.05. The same as below

大腸桿菌組灌胃接種48 h后，取小鼠脾臟和十二指腸，用含有Amp和Kan的麥康凱瓊脂培養基活菌計數。結果如圖5所示，對照組脾臟及十二指腸勻漿中幾乎無宿主菌生長，預防組(1.7×102CFU/g，2.4×105CFU/g)、治療組(4.2×102CFU/g，3.8×105CFU/g)脾臟及十二指腸勻漿中宿主菌數量明顯低于感染組(1.8×104CFU/g，1.9×108CFU/g)，且差異顯著(P<0.05)。說明噬菌體EP-SY對耐藥性SY株大腸桿菌引起的小鼠感染有預防和治療作用。

3 討論

體外殺菌活性試驗發現，噬菌體SP3383和EP-SY分別在與宿主菌作用初始的7 h和5 h內可使宿主菌數量明顯減少，之后上升；羅薇的研究[11]也表明，沙門菌與其噬菌體共培養4 h內宿主菌的OD值呈下降趨勢，4 h后略上升；這種現象可能與細菌針對噬菌體感染產生的抗性有關[12-13]，宿主菌可能通過阻止吸附、抑制DNA注入、阻斷DNA復制、群體感應系統、流產感染等方式抵抗噬菌體，如普遍存在于細菌中的CRISPR-Cas系統，該系統包含規律成簇的間隔性短回文重復序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和與其相關的Cas基因[14]，宿主菌受到噬菌體感染時，會在CRISPR序列前導區插入一段與噬菌體序列一致的間隔序列，應用這一序列合成并加工成小的CRISPR RNA(crRNAs)，誘導細菌降解噬菌體核酸[15-16]。本研究應用的宿主菌以哪種方式抵抗噬菌體值得深入探究。

噬菌體治療效果與其給藥途徑密切相關[17]，目前最常見的給藥途徑是腹腔注射和口服。其中注射給藥主要針對引發菌血癥及敗血癥的病原菌感染，治療胃腸道細菌感染多采用口服方式。進入腸道的噬菌體不僅可在腸腔內定殖，還可通過腸黏膜移位至局部淋巴結及內臟[18]。本研究采用口服噬菌體途徑預防和治療大腸桿菌病和沙門菌感染，發現噬菌體能明顯緩解大腸桿菌或沙門菌對小鼠腸道的損傷，顯著降低脾臟及腸道中宿主菌的數量，但未能完全阻止菌血癥的發生，雖然在實踐中使動物體內病原菌數量控制在最小致死量以下，可以大大減少損失，但如果能采用多株噬菌體同時應用的雞尾酒療法或與其他益生微生物或內酯酶[19]、藥物等聯用，會使其發揮更高的治療價值。