四川省甘孜州藏綿羊梨形蟲(chóng)感染情況的調(diào)查

藍(lán) 嵐，楊丹嬌，潘 瑤，吳建平，李友英，賀安祥，湯 承

(1. 西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041 ； 2. 甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學(xué)研究所，四川 康定 626000 ； 3. 四川省肉牛創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，四川 成都 610041)

四川省甘孜藏族自治州(簡(jiǎn)稱(chēng)甘孜州)位于青藏高原東南緣，是川西北生態(tài)示范區(qū)和國(guó)家生態(tài)屏障區(qū)。畜牧業(yè)是甘孜州基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè)、傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)和優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，藏綿羊是甘孜州的優(yōu)勢(shì)和標(biāo)志性物種之一，也是高原牧民重要的生產(chǎn)生活資料。梨形蟲(chóng)病是一種蜱傳寄生蟲(chóng)病[1]，在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)廣泛分布[2]。梨形蟲(chóng)可感染牛、羊、馬、犬、野生動(dòng)物，其中部分蟲(chóng)種如分歧巴貝斯蟲(chóng)(Babesiadivergens,B.divergens)、田鼠巴貝斯蟲(chóng)(B.microti)和獵戶巴貝斯蟲(chóng)(B.venatorum)還可以感染人[3-4]。梨形蟲(chóng)病的典型臨床特征為發(fā)熱、溶血性貧血、血紅蛋白尿等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[5]； 亞臨床感染可出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、繁殖性能下降等，給畜牧業(yè)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。楊輔國(guó)等[7]、陳德明等[8]先后對(duì)甘孜州部分地方綿羊泰勒焦蟲(chóng)病流行情況進(jìn)行報(bào)道，此后再?zèng)]有其他相關(guān)報(bào)道。近年來(lái)，甘孜州養(yǎng)羊數(shù)量銳減，藏綿羊養(yǎng)殖數(shù)量已從2016年的104萬(wàn)多頭減至2019年的46萬(wàn)余頭，很多地方已不再養(yǎng)殖藏綿羊，選擇甘孜州藏綿羊養(yǎng)殖的主要區(qū)域?yàn)o定、丹巴等9個(gè)縣開(kāi)展甘孜州藏綿羊梨形蟲(chóng)感染情況調(diào)查，對(duì)今后甘孜州藏綿羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 血液樣本 本調(diào)查于2018年6月—2019年5月 采集甘孜州9個(gè)縣臨床健康羊全血352份，樣本信息如下：鄉(xiāng)城縣19份，瀘定縣43份，色達(dá)縣33份， 甘孜縣121份，得榮縣14份，丹巴縣30份，石渠縣32份，白玉縣30份，爐霍縣30份。

1.2 儀器設(shè)備 隔水式恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自Thermoforma公司；高速離心機(jī)，購(gòu)自Eppendorf 公司；DYY-6型電泳儀，購(gòu)自北京市六一儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 全血總DNA提取 采用酚-氯仿法來(lái)進(jìn)行全血總DNA的提取。

1.3.2 檢測(cè)方法 采用西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室建立的梨形蟲(chóng)的巢式PCR方法進(jìn)行檢測(cè)[9]。引物信息：外上游引物：5′-GATAACCGTGCTAATTGTAGG-3′，外下游引物：5′-ATCGTCTTCGATCCCCTAACT-3′，擴(kuò)增片段大小為843 bp；內(nèi)上游引物：5′-AATTGTAGGGCTAATACATGTTCG-3′，內(nèi)下游引物：5′-GAAAACATCCTTGGCAAATGCTTTCGC-3′，擴(kuò)增片段大小為750 bp，靶基因?yàn)?8S rRNA。反應(yīng)體系：第1輪反應(yīng)預(yù)混酶12.5 μL，外引上、下游引物各1 μL(10 μmol/μL)， 第1輪樣本DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。第2輪反應(yīng)預(yù)混酶12.5 μL,內(nèi)引上、下游引物各1 μL(10 μmol/μL)，樣本DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：第1輪反應(yīng)94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；16 ℃反應(yīng)結(jié)束。第2輪反應(yīng)95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火20 s， 72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；16 ℃反應(yīng)結(jié)束。將第2輪PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.3 蟲(chóng)種鑒定 從9個(gè)縣隨機(jī)挑選68份藏綿羊梨形蟲(chóng)核酸陽(yáng)性樣本PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，得到梨形蟲(chóng)序列。通過(guò)NCBI上的BLAST比對(duì)，運(yùn)用Lasergene 7.0 軟件對(duì)測(cè)得序列進(jìn)行同源性分析，采用MEGA 7軟件以Neighbor-Joining法(Bootstrap值為1 000)基于梨形蟲(chóng)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)來(lái)鑒定梨形蟲(chóng)蟲(chóng)種。

1.4 檢測(cè)情況統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)9個(gè)縣藏綿羊檢測(cè)情況統(tǒng)計(jì)，按照半農(nóng)半牧業(yè)縣(鄉(xiāng)城、瀘定、得榮、甘孜、丹巴、爐霍6個(gè)縣)和純牧業(yè)縣(色達(dá)、石渠、白玉3個(gè) 縣)來(lái)劃分進(jìn)行結(jié)果匯總，用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)分析其差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 甘孜州藏綿羊梨形蟲(chóng)的檢測(cè) 本試驗(yàn)采集的352份藏綿羊全血樣本經(jīng)巢式 PCR擴(kuò)增其18S rRNA部分基因序列，其中有147份樣本擴(kuò)增出目的條帶(750 bp)，梨形蟲(chóng)平均陽(yáng)性率為41.76%，部分電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 部分藏綿羊梨形蟲(chóng)巢氏PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of some nesed-PCR products of Tibetan sheep PiroplasmaM：DL 2 000 DNA 標(biāo)準(zhǔn)； 1～12：藏綿羊全血樣本；N：陰性對(duì)照； P：陽(yáng)性對(duì)照M：DL 2 000 DNA marker； 1-12：Blood sample of Tibetan sheep；N：Negative control； P：Positive control

2.2 半農(nóng)半牧縣和純牧業(yè)縣藏綿羊梨形蟲(chóng)的檢測(cè) 甘孜州9個(gè)縣中半農(nóng)半牧業(yè)縣檢出梨形蟲(chóng)核酸陽(yáng)性樣本124份，平均陽(yáng)性率為48.25%。純牧業(yè)縣檢出梨形蟲(chóng)核酸陽(yáng)性樣本23份，平均陽(yáng)性率為24.21%，見(jiàn)表1。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，甘孜州半農(nóng)半牧縣藏綿羊梨形蟲(chóng)感染率顯著高于純牧業(yè)縣(P<0.05)。

表1 甘孜州半農(nóng)半牧縣和純牧業(yè)縣藏綿羊梨形蟲(chóng)檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of Tibetan sheep Piroplasma in the semi-agricultural and semi-pastoral counties and pure animal husbandry counties in Ganzi prefecture

2.3 甘孜州藏綿羊梨形蟲(chóng)蟲(chóng)種的鑒定 從甘孜州7個(gè)縣(除白玉縣和色達(dá)縣)的藏綿羊梨形蟲(chóng)陽(yáng)性樣本中隨機(jī)挑選68份樣本通過(guò)PCR產(chǎn)物測(cè)序鑒定蟲(chóng)種。成功鑒定蟲(chóng)種3個(gè)，其中呂氏泰勒蟲(chóng)46份，陽(yáng)性檢出率為67.65%；綿羊泰勒蟲(chóng)14份，陽(yáng)性檢出率為20.59%；奧氏巴貝斯蟲(chóng)3份，陽(yáng)性檢出率為4.41%。各縣梨形蟲(chóng)蟲(chóng)種情況見(jiàn)表2。

表2 甘孜州藏綿羊梨形蟲(chóng)蟲(chóng)種檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results of Tibetan sheep Piroplasma in Ganzi prefecture

基于PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)鑒定藏綿羊梨形蟲(chóng)蟲(chóng)種。結(jié)果顯示，甘孜州藏綿羊感染的46株泰勒蟲(chóng)序列與GenBank中呂氏泰勒蟲(chóng)陜西株(MG930123)、緬甸株(LC326005)、貴州株(LC326005)聚為一大支且同源性>99%，鑒定為呂氏泰勒蟲(chóng)；感染的14株泰勒蟲(chóng)序列與GenBank中綿羊泰勒蟲(chóng)伊朗株(KX273858)、土耳其株(KT851438)聚為一大支且同源性>99%，鑒定為綿羊泰勒蟲(chóng)；感染的3株巴貝斯蟲(chóng)序列與GenBank中奧氏巴貝斯蟲(chóng)云南株(KY805843、KY805842、KY805840)聚為一大支且同源性>99%，鑒定為奧氏巴貝斯蟲(chóng)。

2.4 甘孜州藏綿羊梨形蟲(chóng)地域分布 甘孜州7個(gè)縣中藏綿羊呂氏泰勒蟲(chóng)分布于瀘定縣、丹巴縣、鄉(xiāng)城縣、得榮縣、爐霍縣和甘孜縣，綿羊泰勒蟲(chóng)分布于鄉(xiāng)城縣和石渠縣，奧氏巴貝斯蟲(chóng)分布于鄉(xiāng)城縣。

3 討論

本試驗(yàn)是首次對(duì)甘孜州州內(nèi)主要藏綿羊養(yǎng)殖的9個(gè)縣開(kāi)展藏綿羊梨形蟲(chóng)感染情況調(diào)查，藏綿羊梨形蟲(chóng)平均陽(yáng)性率達(dá)到41.76%，因采集樣本均為臨床健康樣本，說(shuō)明甘孜州藏綿羊梨形蟲(chóng)亞臨床感染嚴(yán)重。甘孜州半農(nóng)半牧業(yè)縣海拔較低、氣候適宜、植被種類(lèi)多、牲畜流動(dòng)大，適合蜱活動(dòng)和繁殖，藏綿羊梨形蟲(chóng)感染率顯著高于純牧業(yè)縣，試驗(yàn)結(jié)果與胡廣衛(wèi)等[10]對(duì)青海羊泰勒蟲(chóng)病流行情況調(diào)查結(jié)果一致，在一些農(nóng)區(qū)、半農(nóng)半牧區(qū)、林區(qū)的邊緣及有灌木林存在的地方羊泰勒蟲(chóng)病常呈地方性流行。

本試驗(yàn)共鑒定藏綿羊梨形蟲(chóng)蟲(chóng)種3個(gè)，其中呂氏泰勒蟲(chóng)感染率為67.65%，為甘孜州優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種；Zhang等[11]對(duì)甘肅省舟曲縣綿羊血液進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)舟曲縣呂氏泰勒蟲(chóng)檢出率為67%；鐘維等[9]對(duì)采自四川阿壩州壤塘、小金、紅原縣的藏綿羊全血進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，呂氏泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性率為75.0%。綜上結(jié)果表明，呂氏泰勒蟲(chóng)在青藏高原綿羊中廣泛分布。呂氏泰勒蟲(chóng)為惡型泰勒蟲(chóng)，泰勒蟲(chóng)子孢子隨蜱蟲(chóng)盯咬進(jìn)入宿主體內(nèi)，以裂殖生殖的方式進(jìn)行繁殖。在繁殖階段，裂殖體可引起淋巴細(xì)胞大量增殖，被感染的動(dòng)物表現(xiàn)出貧血及不同水平的蟲(chóng)血癥，嚴(yán)重者甚至造成宿主死亡[12-13]。本次試驗(yàn)未對(duì)梨形蟲(chóng)傳播媒介蜱的種類(lèi)與分布進(jìn)行調(diào)查，需要進(jìn)一步進(jìn)行調(diào)查研究，同時(shí)，由于感染情況較為嚴(yán)重，下一步有必要開(kāi)展甘孜州藏綿羊梨形蟲(chóng)病的防治工作。