新疆2種優(yōu)勢(shì)革蜱攜帶馬梨形蟲(chóng)和饒氏立克次體病原的檢測(cè)

李 敏，呼爾查，黨娜娜，樊新麗，李才善，哈希巴特，巴音查汗

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052 ； 2.新疆和靜縣畜牧獸醫(yī)站，新疆 和靜 830014)

硬蜱是一類(lèi)寄生于脊椎動(dòng)物體表的吸血節(jié)肢動(dòng)物，是許多自然疫源性疫病的傳播媒介或貯存宿主，通過(guò)直接叮咬傳播其所攜帶的病原體[1]。新疆昭蘇縣與和靜縣兩地均常年雨水較多，草原面積較大，自然放牧家畜較多，隨之硬蜱孳生也廣泛，加之不同地區(qū)存在多種不同的優(yōu)勢(shì)硬蜱，其攜帶的病原種類(lèi)也較為復(fù)雜，導(dǎo)致多種蜱傳疾病流行[2]。

馬梨形蟲(chóng)病是馬梨形蟲(chóng)寄生于馬、驢、騾等馬屬動(dòng)物紅細(xì)胞，通過(guò)媒介蜱叮咬而傳播的一種血液原蟲(chóng)病，病原包括馬泰勒蟲(chóng)和馬駑巴貝斯蟲(chóng)，其主要癥狀為體溫升高、黃疸、貧血和血紅蛋白尿等，病情嚴(yán)重或治療不及時(shí)可導(dǎo)致馬匹死亡[3]。該病在世界各地廣泛流行，在我國(guó)31省市幾乎均有該病病原分離或疾病發(fā)生的報(bào)道，對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)的生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，尤其馬匹數(shù)量較多的新疆地區(qū)頻發(fā)馬蜱傳血液原蟲(chóng)病，也成為了阻礙新疆馬產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一[4]。饒氏立克次體是引起蜱傳淋巴結(jié)炎和蜱傳壞死紅斑淋巴結(jié)病的病原，傳染人可導(dǎo)致腦膜炎的發(fā)生[5]。新疆地處我國(guó)西部，在 “一帶一路”戰(zhàn)略實(shí)施的便利條件下，大型草食家畜及哺乳動(dòng)物體表硬蜱的寄生及馬梨形蟲(chóng)病和饒氏立克次體在昭蘇伊犁馬與和靜縣焉耆馬群中的流行不僅阻礙了區(qū)域性養(yǎng)馬業(yè)的發(fā)展，也對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生了危害[6]。近幾年，新疆關(guān)于許多動(dòng)物病原的監(jiān)測(cè)多以血液為樣本，對(duì)于以蜱蟲(chóng)為樣品的蜱病原檢測(cè)的報(bào)道較少。本試驗(yàn)在媒介革蜱種屬鑒定及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的基礎(chǔ)上，以2種當(dāng)?shù)貎?yōu)勢(shì)種媒介生物為研究樣本，通過(guò)PCR揭示不同硬蜱所攜帶蜱傳病原的情況，從而為不同地區(qū)擬采取蜱傳疾病的綜合防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 2019年4月于新疆昭蘇采集了雌蜱93只、新疆和靜采集了95只寄生于馬體表(頸部、背部及后腿內(nèi)側(cè))的雌蜱，共188只成年雌蜱。樹(shù)脂型基因組 DNA 提取試劑盒，購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。RA-DIAL20 高速離心機(jī)，購(gòu)自西班牙ORTO ALRESA公司；PCR儀和Gel Doc 2000紫外凝膠成像儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；DYCP-31DN型瓊脂糖電泳儀，購(gòu)自北京六一公司；2×EcoTaq PCR SuperMix，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DL2 000 DNA marker，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 硬蜱樣品DNA的提取 通過(guò)液氮將硬蜱組織研磨于1.5 mL，加入200 μL PBS緩沖液后，按照樹(shù)脂型基因組 DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取硬蜱的DNA，-20 ℃保存。

1.2.2 PCR擴(kuò)增馬泰勒蟲(chóng)、馬駑巴貝斯蟲(chóng)和饒氏立克次體目的片段 擴(kuò)增革蜱COI基因的引物參照文獻(xiàn)[7]合成，對(duì)2個(gè)采樣點(diǎn)的DNA進(jìn)行Bc48、18S rRNA和16S rRNA基因擴(kuò)增參照文獻(xiàn)[8-9]，引物序列及反應(yīng)條件見(jiàn)表1。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行引物合成。反應(yīng)體系：2×EcoTaq PCR SuperMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL， DNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

表1 引物序列及反應(yīng)條件Table 1 Primer sequence and reaction condition

1.2.3 PCR陽(yáng)性產(chǎn)物的回收、純化及測(cè)序 將COI基因、馬駑巴貝斯蟲(chóng)和饒氏立克次體擴(kuò)增的特異性條帶切下，按DNA凝膠回收試劑盒的說(shuō)明書(shū)將陽(yáng)性DNA的條帶進(jìn)行回收，并將膠回收產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 蜱種及其攜帶病原的同源性分析 將測(cè)得的核酸序列在NCBI上用BLAST進(jìn)行比對(duì)，找到與其相似的序列。利用MEGA 6.0軟件對(duì)測(cè)得的序列進(jìn)行序列比對(duì)并用最大似然法(Maximum likelihood,ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)勢(shì)分子生物學(xué)鑒定及其病原檢測(cè) 以新疆和靜、昭蘇2個(gè)采樣點(diǎn)的蜱DNA 為樣品，用PCR方法擴(kuò)增COI基因片段，經(jīng)熒光成像可見(jiàn)，在700 bp左右出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)；通過(guò)PCR擴(kuò)增馬駑巴貝斯蟲(chóng)、饒氏立克次體的部分基因片段分別在約450 bp、1 332 bp出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期目的片段大小一致(圖2、圖3)，馬泰勒蟲(chóng)未出現(xiàn)條帶，最后經(jīng)過(guò)測(cè)序得到以上2種病原的基因序列。

圖1 COI基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplification of COI gene by PCRM：DL 2 000 DNA 標(biāo)準(zhǔn)； 1～5：部分樣品； 6：陰性對(duì)照M: DL 2 000 DNA marker; 1-5: Partial sample; 6: Negative control

圖2 Bc48基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 Amplification of Bc48 gene by PCRM：DL 2 000 DNA marker； 1：陽(yáng)性對(duì)照;2～5：部分樣品; 6：陰性對(duì)照M: DL 2 000 DNA marker; 1: Positive control;2-5: Partial sample; 6:Negative control

圖3 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增Fig.3 Amplification of 16S rRNA gene by PCRM：DL 2 000 DNA marker； 1：陽(yáng)性對(duì)照；2～9：部分樣品； 10：陰性對(duì)照M: DL 2 000 DNA marker; 1: Positive control;2-9: Partial sample; 10: Negative control

2.2 新疆昭蘇與和靜2個(gè)采樣點(diǎn)樣品陽(yáng)性率 通過(guò)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，昭蘇采樣點(diǎn)、和靜采樣點(diǎn)的馬泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性率為0；2個(gè)采樣點(diǎn)馬駑巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性率分別為30.1%和6.3%；饒氏立克次體陽(yáng)性率分別為6.5%和36.8%。見(jiàn)表2。

表2 2種優(yōu)勢(shì)硬蜱攜帶病原的陽(yáng)性率Table 2 Positive rate of pathogen carried by two dominant Ixodidaes

2.3 2種優(yōu)勢(shì)硬蜱及其攜帶病原的進(jìn)化分析

2.3.1 2種優(yōu)勢(shì)硬蜱的進(jìn)化樹(shù)分析 測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，昭蘇陽(yáng)性樣品(seq1)測(cè)得序列與邊緣革蜱(KF583568.1)的相似性最高，為99.85%，和靜陽(yáng)性樣品(seq2)測(cè)得序列與森林革蜱的相似度最高，為98.83%。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，下載革蜱屬蟲(chóng)種同基因相關(guān)序列，以亞洲璃眼蜱為外類(lèi)群，在MAGA 6.0軟件中ML構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示，新疆昭蘇與和靜待鑒定蜱分別與邊緣革蜱聚和森林革蜱聚為一支，分別與同種的中國(guó)新疆株(KF583568.1)和新疆株(MK307806.1)遺傳距離最小。

圖4 基于COI基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Construction of phylogenetic evolutionary tree based on COI gene▲:本試驗(yàn)分離株▲:The strains isolated in this experiment

2.3.2 馬駑巴貝斯蟲(chóng)和饒氏立克次體的檢測(cè)分析 將病原陽(yáng)性測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的已知序列進(jìn)行Blast比對(duì)，與馬駑巴貝斯蟲(chóng)病原相似度較高的為中國(guó)新疆株(MK307869.1)和泰國(guó)株(KP162170.1)，相似度分別為98.45%和97.23%。與饒氏立克次體的序列相似度最高的是中國(guó)甘肅株(MH923224.1)和中國(guó)山西株(MH923214.1)，相似度均為99.66%。

3 討論

據(jù)報(bào)道，北疆地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種硬蜱包括草原革蜱、森林革蜱、邊緣革蜱、銀盾革蜱和巴氏革蜱等[10-11]；張桂林等[12]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，山地森林和山地灌叢草原分布有森林革蜱和邊緣革蜱2種硬蜱，隨著生態(tài)環(huán)境的變化，硬蜱種類(lèi)的形態(tài)也在不斷變化。因此，本試驗(yàn)通過(guò)COI基因片段擴(kuò)增了所采集硬蜱樣品DNA，再與GenBank上的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果顯示，新疆昭蘇與和靜采樣點(diǎn)優(yōu)勢(shì)種硬蜱分別與邊緣革蜱和森林革蜱相似度最高。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)也顯示，兩縣采樣點(diǎn)優(yōu)勢(shì)種硬蜱分別與邊緣革蜱和森林革蜱的新疆株親緣關(guān)系最近，與北疆優(yōu)勢(shì)硬蜱分布情況一致。

馬梨形蟲(chóng)病在熱帶、亞熱帶和一些溫帶地區(qū)較為流行，且在世界范圍內(nèi)的流行與有效蜱媒介在世界范圍內(nèi)的分布是一致的，革蜱屬、璃眼蜱屬和扇頭蜱屬的蜱蟲(chóng)均可傳播該病病原[13-14]。新疆昭蘇與和靜地區(qū)均為溫帶大陸性氣候及其滋生的優(yōu)勢(shì)硬蜱，為馬駑巴貝斯蟲(chóng)病的流行提供了適宜條件。2015年和靜地區(qū)馬泰勒蟲(chóng)和馬駑巴貝斯蟲(chóng)的感染率分別為14.7%和58.8%[15]；2016年對(duì)昭蘇進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，馬泰勒蟲(chóng)和馬駑巴貝斯蟲(chóng)的感染率分別為36%和28%[16]。昭蘇與和靜是馬泰勒蟲(chóng)病的常發(fā)地區(qū)，本試驗(yàn)使用與往年同樣靶基因檢測(cè)病原但結(jié)果有部分差異，可能與本試驗(yàn)采樣范圍單一的局限性和檢測(cè)方法的靈敏度變化等方面的因素有很大關(guān)系，同一地區(qū)也可能因?yàn)椴煌臅r(shí)間點(diǎn)和采樣點(diǎn)檢測(cè)到的病原攜帶情況不同。因此，馬梨形蟲(chóng)每年的感染率都在不斷變化，所以根據(jù)實(shí)時(shí)的病原檢測(cè)的結(jié)果而不斷地更改防控措施和有針對(duì)性的尋找防控重點(diǎn)地區(qū)是必要的。

2014年中蒙和中俄邊境地區(qū)草原革蜱立克次體攜帶高達(dá)66.5%，2016年新疆哈巴河縣邊緣革蜱饒氏立克次體的感染率為17.6%[17-18]。本次試驗(yàn)中和靜縣試驗(yàn)點(diǎn)的森林革蜱所攜帶饒氏立克次體的陽(yáng)性率為36.8%，是2016年哈巴河縣的感染率的2倍，是本次試驗(yàn)中昭蘇縣試驗(yàn)點(diǎn)邊緣革蜱的6倍。將經(jīng)過(guò)16S rRNA擴(kuò)增的序列比對(duì)，與甘肅相似度最高，這可能與新疆和甘肅地域相鄰，氣候、人類(lèi)活動(dòng)和動(dòng)物遷移有關(guān)。蜱對(duì)環(huán)境變化也很敏感，所以作為媒介生物攜帶病原的情況也越來(lái)越復(fù)雜。因此，不斷的監(jiān)測(cè)每年動(dòng)物攜帶蜱傳疾病情況，明確動(dòng)物疾病的媒介蜱種類(lèi)是公共衛(wèi)生安全的必要措施。在 “一帶一路”戰(zhàn)略實(shí)施的便利發(fā)展條件下，大型家畜及哺乳動(dòng)物體表革蜱的寄生及其傳播疾病感染率不斷上升，成為嚴(yán)重阻礙新疆畜牧業(yè)和人類(lèi)健康發(fā)展的重要因素之一，防蜱控蜱已成為畜牧業(yè)長(zhǎng)期優(yōu)質(zhì)發(fā)展所迫切需要解決的問(wèn)題。