脂多糖致小鼠急性肺損傷模型給藥劑量和時間的篩選

王顯峰，白薩日娜

(1.扎蘭屯職業學院，內蒙古 扎蘭屯 162650 ； 2.內蒙古醫科大學基礎醫學院，內蒙古 呼和浩特 010110)

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)是指各種直接或間接因素所致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，大量蛋白液積聚造成急性肺水腫，導致嚴重的急性呼吸衰竭，影像學表現是兩肺滲出性病變，氧合指數<300[1]。急性肺炎是肺炎、敗血癥、創傷等引起的肺部炎癥之一，在ALI中，中性粒細胞是炎癥和發病機理的主要參與者，因此，當肺臟發生炎性病變時，外周血中大量的白細胞，尤其是中性粒細胞會聚集在患病部位，在肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和病理組織樣本中有大量的多形核中性粒細胞，而外周血中的中性粒細胞(Polymorphonuclear，PMN)減少[2]。國內外研究人員一般采用氣管滴入或腹腔注射脂多糖制造小鼠急性肺損傷模型[3-4]，本試驗采用了對小鼠創傷較小的滴鼻方式，系統地比較了不同時間、不同脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)濃度的最適造模條件。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本試驗選用清潔級昆明小鼠，雄性，48只，6～8周齡，18～22 g，由內蒙古大學國家清潔級實驗動物繁育室提供。

1.2 試驗分組與設計 小鼠試驗前禁食12 h，自由飲水。將小鼠隨機分成8組，每組6只，分別為造模劑量組、造模時間組和空白對照組(Control)。造模劑量組每只小鼠滴鼻劑量分別為1、2 mg/(kg·bw)和5 mg/(kg·bw)的脂多糖，滴鼻6 h后取樣。造模時間組分別于滴鼻后6、12、24 h和48 h進行取樣，給藥劑量均為2 mg/(kg·bw)。空白對照組小鼠滴鼻等體積0.9%NaCl。試驗分別取每組每只小鼠肺灌洗液用來檢測TNF-α、IL-6、IL-1β含量，取小鼠外周血鏡下計算中性粒細胞數量，取左肺計算濕干重比，取右肺做病理切片。

1.3 試驗材料 脂多糖LPS(46M4045V)，購自美國Sigma公司；IL-1β、TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒，均購自美國eBioscience公司；酶標板，購自美國康寧有限公司；蘇木素-伊紅染液及其他試劑，均購自南京建成生物科技有限公司。

1.4 肺組織切片及蘇木精-伊紅染色 取部分小鼠右肺組織，置入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定12 h，常規石蠟包埋，連續切片，以中性樹膠封片。

1.5 肺濕干重比計算 取完整小鼠左肺，用濾紙吸取肺組織表面的血液，干燥稱量紙上稱得濕重(W)，置72 ℃恒溫箱，烘烤48 h后稱量干重(D)，以濕干重比(W/D)表示肺組織含水量。

1.6 細胞因子的測定 采用ELISA方法測定小鼠肺灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β含量，按照試劑盒說明書步驟進行操作，在吸光度560 nm處用酶標儀檢測其含量，記錄數據。

1.7 中性粒細胞(PMN)百分比 取適量小鼠外周血，做血涂片后用瑞氏-吉姆薩染色液染色，晾干后進行細胞計數，中性粒細胞百分比(PMN%)=中性粒細胞總數/白細胞總數×100%。

1.8 數據統計與分析 所有數據需要進行統計學分析，使用SPSS Statistics 17.0軟件對數據進行方差分析。

2 結果

2.1 小鼠臨床癥狀 本試驗模型各組小鼠均出現明顯精神沉郁，食欲減退現象。其中造模6 h、9 h組和給藥劑量1、2、5 mg/(kg·bw)組小鼠出現群聚，個別小鼠出現呼吸頻率增加，尤其是5 mg/(kg·bw) 組小鼠呈現精神萎靡，團索一起，飲食廢絕，體重明顯減輕；12 h組小鼠后期基本恢復正常。

2.2 肺組織病理形態學觀察 如中插彩板圖1所示，從病理切片結果顯示，按炎癥分級情況進行病理學評定：空白對照組小鼠肺組織形態完整，肺泡壁薄，肺泡腔內無滲出物，肺泡結構完整(封底彩版圖1A)；3、6、9 h組和12 h組小鼠肺組織結構均出現不同程度模糊，肺泡腔內可見炎性細胞浸潤，巨噬細胞增多，肺泡間隔明顯增厚，肺部炎癥明顯(封底彩版圖1B、1C、1D、1E箭頭)，尤其以6 h組和9 h 組最嚴重(封底彩版圖1C、1D)；1 mg/(kg·bw)組肺部炎癥程度較輕，見少量炎癥細胞浸潤，氣管結構完整，支氣管黏膜下無大量淋巴細胞浸潤(封底彩版圖1F箭頭)；2、5 mg/(kg·bw)組肺部炎癥較明顯(封底彩版圖1G和1H箭頭)。

圖1 小鼠肺臟組織病理學檢測 (H.E.染色，100×)Fig.1 Mice lung tissues detected by histopathology (H.E. staining,100×)A：空白對照組； B：3 h組； C：6 h 組； D：9 h 組； E:12 h 組； F：1 mg/(kg·bw)組； G：2 mg/(kg·bw)組； H：5 mg/(kg·bw)組A:Blank control group; B:3 h group; C:6 h group; D:9 h group; E:12 h group; F:1 mg/(kg·bw) group;G:2 mg/(kg·bw) group; H:5 mg/(kg·bw) group

2.3 肺組織濕干重比 造模時間組小鼠于滴藥后3、6、9 h和12 h肺組織濕干重比明顯高于空白對照組，其中6 h組小鼠肺組織濕干重比顯著高于空白對照組(P<0.05)，見表1。2、5 mg/(kg·bw)組小鼠肺組織濕干重比極顯著高于對照組(P<0.01)，見表2。

表1 小鼠急性肺損傷不同造模時間肺濕干重比Table 1 Lung wet and dry weight ratio of mice with acute lung injury at different modeling times

表2 不同造模濃度肺濕干重比Table 2 Lung wet and dry weight ratio at different modeling concentrations

2.4 急性肺損傷模型時間及濃度篩選 造模時間組小鼠滴藥后6、9 h和12 h肺組織IL-6、TNF-α和IL-1β水平極顯著高于空白對照組(P<0.01)，其中6 h組肺組織IL-6、TNF-α和IL-1β水平高于其他各組，如表3所示。脂多糖2、5 mg/(kg·bw)組小鼠肺組織IL-6、TNF-α和IL-1β水平極顯著高于空白對照組(P<0.01)，如表4所示。

表3 不同造模時間細胞因子的表達水平Table 3 The expression level of cytokines at different modeling times

表4 不同造模濃度細胞因子的表達水平Table 4 The expression level of cytokines at different modeling concentrations

2.5 中性粒細胞百分比 中性粒細胞百分比結果見表5和表6。造模時間各組PMN百分比均明顯低于空白對照組，其中3 h組PMN百分比顯著低于空白對照組(P<0.05)，6、9 h組和12 h組PMN百分比極顯著低于空白對照組(P<0.01)，如表5所示。造模濃度各組PMN百分比均明顯低于空白對照組，其中1 mg/(kg·bw)組PMN百分比顯著低于空白對照組(P<0.05)，2、5 mg/(kg·bw)組PMN百分比極顯著低于空白對照組(P<0.01)，如表6所示。

表5 不同造模時間PMN百分比Table 5 PMN percentages at different modeling times

表6 不同造模濃度PMN百分比Table 6 PMN percentages at different modeling concentrations

3 討論

急性肺損傷(ALI)致病因素較多，其致死率頗高，但目前臨床上特效藥較少，其發病機制也尚未明確。目前小鼠、大鼠是研究ALI最常見的實驗動物[5]。脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌細胞壁中的一種成份，只有在細菌死亡、繁殖或人工破壞時，才會釋放到細胞外，發揮其各種效應。由于脂多糖對宿主有一定的毒性，因此，也叫做內毒素，在科學研究上常作為誘導物，用于小鼠、大鼠急性肺炎模型的建立[6-7]。臨床上常用尾靜脈注射藥物、腹腔注射藥物、氣管滴入藥物以及盲腸結扎穿刺方法建立急性肺損傷模型，王婷等[8]通過試驗比較上述幾種方法發現，腹腔注射藥物和氣管滴入更適合ALI模型的建立。本試驗采用對動物機體刺激較小的氣管滴入方法，在此基礎上改進具體滴藥模式，將滴入劑量分3次滴入發現效果更好。據現有關于ALI模型條件篩選的報道，筆者發現部分學者只篩選時間[9]，對于單獨篩選LPS濃度的研究未見報道，目前臨床常用LPS造模濃度為10[10]、5 mg/(kg·bw)[11]和2 mg/(kg·bw)[12]。本試驗在各種因素相同條件下同時造模篩選時間和LPS濃度，更加符合ALI模型建立的實際情況。

本試驗采用鼻孔滴注方法，設置了造模劑量組[1、2 mg/(kg·bw)和5 mg/(kg·bw)]和造模時間組(3、6、9 h和12 h)旨在建立小鼠ALI模型最佳條件，本試驗通過測定ALI的典型指標，病理組織變化、肺干濕重、炎癥因子水平，來綜合評價ALI模型是否成功。試驗結果顯示，當LPS濃度為2 mg/(kg·bw)， 造模時間為6 h時，炎癥因子表達量最高且肺濕干重比最明顯，中性粒細胞也極顯著減少，小鼠肺臟病理切片可見明顯炎性病變，視為最佳造模條件。盡管LPS造模9 h、濃度5 mg/(kg·bw) 炎癥因子表達量、肺濕干重比、PMN百分比等指標與空白對照組相比也有顯著差異，但綜合小鼠臨床狀態表現，上述條件不適合作為ALI模型的最佳條件。