高效液相色譜法檢測德拉昔布咀嚼片含量方法的建立

于泓瀟，李思鴻，肖天石，張藝馨，楊雨齊，李佳瑞，楊洪亮，張秀英

(東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

德拉昔布屬于非甾體類解熱鎮痛抗炎藥物，化學名為4-[5-(3-氟-4-甲氧基苯基)-3-二氟甲基-1H-咪唑-1-基]苯磺酰胺，分子式為C17H14F3N3O3S，分子量為397.38，是環氧酶-2選擇性抑制劑中的一員，也是第1款被美國食品及藥物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批準用于犬的環氧酶-2選擇性抑制劑[1]，臨床上用于治療犬的骨關節炎癥及疼痛，并可預防犬牙科與骨科手術后的疼痛[2]。德拉昔布對環氧酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)具有高度的選擇性抑制作用，從而阻斷下游致炎、致痛性前列腺素合成[3]，產生抗炎和鎮痛作用，而對環氧酶-1(Cyclooxygenase-1，COX-1)抑制作用較小，因此對COX-1的正常生理性功能影響較小[4]。相比于其他非選擇性環氧酶抑制劑，即傳統非甾體抗炎藥物(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)，德拉昔布對消化系統的損害(如潰瘍、出血、黏膜損傷)明顯減輕[5-6]。因其抗炎、鎮痛效果好，胃腸道副作用小等優勢，在治療犬骨關節炎、風濕性關節炎引起的疼痛等方面，德拉昔布已逐漸替代其他非選擇性環氧酶抑制劑，成為美國獸醫臨床治療的主流選擇[7]。

目前，德拉昔布咀嚼片(Deracoxib chewable tablets)尚未在中國大陸上市，對其含量測定方法也未見報道。本試驗建立了高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)檢測德拉昔布咀嚼片含量的方法，并對實驗室自制的德拉昔布咀嚼片與美國已經上市的Deramaxx咀嚼片進行含量檢測，為德拉昔布咀嚼片質量標準的建立以及產品的質量控制提供依據[8-9]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 德拉昔布咀嚼片(實驗室自制，規格25 mg，批號：20180507、20180514、20180521)；德拉昔布標準品(北京Absin公司，CAS號：169590-41-4，純度 99%)；Deramaxx(美國Novartis公司，規格：25 mg，批號：175227C)；乙腈(色譜純，美國Sigma公司)；甲醇(色譜純，山東禹王和天下材料有限公司)；磷酸二氫鉀(分析純，西隴科學有限公司)。

1.2 主要儀器 Waters e2695高效液相色譜系統(美國Waters公司)；Waters 2998 紫外檢測器(美國 Waters公司)；AL 204 電子分析天平(梅特勒-托利多儀器公司)；KQ-100E型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；PB-10酸度計(德國Sartorius公司)。

1.3 色譜條件與系統適應性 色譜柱為Wasters C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相為磷酸鹽緩沖液(pH=4.5)∶乙腈 (52∶48，v/v)；檢測波長252 nm； 流速1 mL/min；柱溫30 ℃。

1.4 溶液配制

1.4.1 對照品溶液配制 精密稱取2.5 mg德拉昔布標準品，1 mL甲醇溶解，定容至250 mL容量瓶制成含德拉昔布0.01 mg/mL的溶液，作為對照品貯備液。

1.4.2 供試品溶液配制 分別取標示量為25 mg德拉昔布咀嚼片和Deramaxx，充分研碎，加入適量甲醇定容至250 mL容量瓶中作為供試品儲備液，超聲處理20 min，取2 mL供試品貯備液以3 000 r/min離心10 min，精密吸取上清1 mL供試品儲備液定容至25 mL容量瓶中，作為供試品。

1.5 專屬性 按德拉昔布咀嚼片處方壓出空片(不含主藥德拉昔布，使用等量淀粉替代)，按1.4.2方法制成空白輔料溶液，另分別取標示量25 mg的德拉昔布咀嚼片和Deramaxx，同樣按1.4.2方法處理，樣品經0.22 μm濾膜濾過后，取上述溶液各10 μL， 注入HPLC，記錄色譜圖與峰面積。

1.6 HPLC測定的方法學研究[10]

1.6.1 線性關系 精密稱定德拉昔布標準品25 mg，按1.4.1方法操作，稀釋成0.01 mg/mL對照品儲備液，分別取0.5、1、2、4 mL和8 mL儲備液，以甲醇定容至10 mL容量瓶中，配成含量分別為0.5、1、2、4 μg/mL和8 μg/mL一系列濃度的德拉昔布標準品溶液，分別取10 μL注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標，進樣濃度為橫坐標作圖并進行回歸分析，應用SPSS 22.0建立標準曲線并進行相關性分析。

1.6.2 儀器精密度 按1.4.1方法制成對照品貯備液，取對照品溶液儲備液4 mL定容到10 mL容量瓶中，配成含量為4 μg/mL的德拉昔布，取10 μL注入HPLC，連續進樣6次，記錄色譜圖與峰面積。

1.6.3 重復性 日內重復性：按1.4.2方法分別平行配置供試品5份，各取10 μL在同天進樣，記錄色譜圖與峰面積。日間重復性：按1.4.2方法分別在5 d內每天配制供試品一份，每次進樣10 μL，記錄色譜圖與峰面積。

1.6.4 靈敏度 按1.4.1方法配制對照品貯備液，逐步稀釋進行檢測，以Empower 2軟件建立的處理方法計算信噪比，依據信噪比在3左右時，確定檢測限(Limit of detection，LOD)，依據信噪比在10左右時，確定定量限(Limit of quantification，LOQ)。

1.6.5 溶液穩定性 按1.4.1方法配置好對照品，分別在0、2、4、8、16 h和24 h測定對照品的含量變化，評價德拉昔布在甲醇溶劑中的穩定性。

1.6.6 回收率 采用加樣回收率測定法，精密稱定德拉昔布咀嚼片適量，按1.4.2方法平行配制供試品3份，分別按已知對照品含量的80%、100%和120%精密添加德拉昔布標準品，各取10 μL注入HPLC，重復3次上述操作，記錄色譜圖與峰面積。

1.7 耐用性[11]將方法的流動相比例，磷酸鹽緩沖液pH，流速與柱溫進行微小改變，考察細微的色譜條件變化對含量測定結果的影響，精密稱定已知含量的德拉昔布標準品，按1.4.1方法配制，進樣10 μL，記錄色譜圖與峰面積。

1.8 含量測定 選取不同批次的德拉昔布咀嚼片與Deramaxx，按1.4.2方法配制供試品，以建立的德拉昔布咀嚼片含量測定法測定，進樣10 μL，記錄色譜圖與峰面積。

2 結果

2.1 專屬性 專屬性結果如圖1～3所示，德拉昔布保留時間約為10.9 min，空白輔料不會對主藥德拉昔布峰產生干擾，表明該方法的專屬性良好。

圖1 空白輔料液相色譜圖Fig.1 The liquid chromatogram of blank excipients

圖2 德拉昔布咀嚼片液相色譜圖Fig.2 The liquid chromatogram of deracoxib chewable tablets

圖3 Deramaxx液相色譜圖Fig.3 The liquid chromatogram of Deramaxx

2.2 HPLC測定的方法學研究 結果見表1。經SPSS 22.0處理數據得到樣品濃度C(Concentration)與峰面積A(Peak area)的回歸方程A=31 577C+3 514.7 (r2=0.999 2)，經回歸分析得到Sig<0.01，峰面積與濃度顯著相關，說明在0.5～8 μg/mL的濃度范圍內，德拉昔布的濃度與峰面積顯著相關，且相關性良好。建立的HPLC法檢測德拉昔布的檢測限與定量限分別為0.051 μg/mL和0.16 μg/mL；方法的平均回收率為(99.68±0.53)%，符合回收率規定在98%～102%，RSD<2%；日內與日間重復性分別為0.94%和1.85%，均<2%，符合有關規定；儀器精密度結果為0.56%<2%，表明儀器精密度良好，其結果可信；溶液穩定性結果為0.57%<2%，表明德拉昔布24 h以內在甲醇溶劑中穩定。經過以上方法學考察，證明該檢測方法可行。

表1 HPLC法檢測德拉昔布咀嚼片的方法學考察Table 1 The validation of HPLC for the determination of deracoxib chewable tablets

2.3 耐用性 結果見表2。經細微改變流動相比例，磷酸鹽緩沖液pH，流速與柱溫，考察對含量測定的影響。不同條件下，其含量結果的RSD為0.82%，說明細微的條件改變對含量結果基本無影響，方法耐用性良好。

表2 HPLC法檢測德拉昔布咀嚼片的條件耐用性Table 2 Robustness of the HPLC method for determination of deracoxib chewable tablets

2.4 3批樣品的含量測定 含量測定結果見表3。3批樣品的含量均在90%～110%，符合獸藥典關于片劑含量的要求。

表3 不同批次的德拉昔布咀嚼片含量Table 3 Content of deracoxib chewable tablets in different batches

3 討論

關于波長選擇，對德拉昔布進行全波長掃描，發現252 nm處，吸收值較大，有關物質也有一定吸收，但輔料在此波長下無吸收。從而確定在252 nm處測定德拉昔布的含量。

關于溶劑的選擇，因為德拉昔布難溶于水，易溶于DMSO，可溶于甲醇、乙腈，所以分別對3種溶劑進行考察，3種溶劑對于有關物質以及含量影響不大，所以最終選擇價格比乙腈、DMSO便宜的甲醇作為溶劑。

關于流動相的選擇，最開始使用水與乙腈作為流動相，經過適當比例調整后，發現峰型不理想，于是把水換成不同pH磷酸鹽緩沖液進行考察[12]，發現pH為4.5時，德拉昔布主峰的峰型最好，經過適當的比例調整，最終確定流動相為磷酸鹽緩沖液(pH=4.5)∶乙腈(52∶48，v/v)。

樣品的溶解超聲時間確定，德拉昔布咀嚼片被粉碎后，用甲醇溶解，超聲粉碎處理。為考察超聲時間的影響，分別超聲10、20 min和30 min考察對含量測定的影響[13]，在既保證德拉昔布完全從輔料中釋放溶解，又保證工作效率的前提下，超聲時間最終定為20 min。

德拉昔布作為一款還未在我國上市的犬類專用環氧酶抑制劑，建立穩定、有效的含量測定方法對于今后德拉昔布質量標準的制定可以提供理論依據。所建立的方法專屬性強，準確度高，重現性好，符合相關要求，可用于德拉昔布咀嚼片的含量測定。