丁香微乳的質量控制試驗

何曉蓓，冉 洋，賀濤濤，范云鵬，麻武仁，劉迎秋，宋曉平

(西北農林科技大學動物醫學院，陜西 楊凌 712100)

丁香為桃金娘科植物丁香(EugeniacaryophyllataThunb.)的干燥花蕾，溫中降逆，補腎壯陽，主治胃寒嘔吐、肚脹、冷腸泄瀉、腎虛陽痿[1]。現代藥理研究表明，丁香具有抗氧化、殺菌、殺螨、解熱鎮痛等作用[2-3]。化學成分研究發現，丁香主要含丁香酚、石竹烯、α-葎草烯等成分[4]。阮娜等[5]從200味中藥提取物中發現丁香殺螨活性最為突出，其活性成分為丁香酚。郭超[6]將丁香提取物制成丁香微乳制劑。本試驗采用薄層色譜法(TLC)對丁香微乳進行定性鑒別，采用高效液相色譜法(HPLC)測定丁香酚含量，旨為該制劑的質量控制及進一步應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物 丁香提取物(丁香酚含量為58.70 mg/g)，實驗室自制(批號：20170114)；丁香酚對照品(純度99.3%，批號：110725-201615)，丁香對照藥材(批號：121039-201405)，均購自中國食品藥品檢定所。

1.1.2 主要試劑 聚氧乙烯氫化蓖麻油40(RH40)，藥用輔料，批號：73870868E0，德國巴斯夫；油酸乙酯(EO)，藥用輔料，批號:YO20170905，山東瑞生藥用輔料有限西安公司；丙二醇，藥用輔料，批號：20171002，江西益普生藥業有限公司；甲醇，色譜純，批號：20171223，天津市科密歐化學試劑有限公司；硅膠G薄層板(100 mm×100 mm)，批號：20170831，青島海洋化工有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 主要儀器 SP-20E型全自動薄層色譜點樣儀，上海科哲生化科技有限公司；2F-8型暗箱四用紫外分析儀，上海勤科分析儀器有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津。

1.2 方法

1.2.1 丁香微乳的制備 稱取RH40 54 g、丙二醇18 g、EO8 g攪拌均勻作為丁香微乳的油相。向油相中加入丁香提取物2 g，攪拌均勻后3 000 r/min離心15 min，取上清液。稱取加提取物微乳油相 40 g， 逐滴加蒸餾水60 g，邊滴加邊攪拌即得[6]。

1.2.2 丁香微乳的鑒別 (1)對照品溶液的制備：參照《中國獸藥典》2015版二部中的方法，取丁香酚對照品，加乙醚制成每1 mL中含16 μL的溶液，作為丁香酚對照品溶液[1]。(2)對照藥材溶液的制備：參照《中國獸藥典》2015版二部中的方法，取丁香對照藥材粉末0.50 g置錐形瓶內，加5 mL乙醚，振搖1 min，過濾，濾液作為丁香對照藥材溶液[1]。(3)供試品溶液的制備：稱取丁香微乳20.02 g，加無水硫酸鈉2.01 g，超聲破乳30 min，加石油醚(30～60 ℃)20 mL萃取3次，合并石油醚萃取液層，室溫揮干，加乙醚2 mL溶解即得[7]。(4)陰性對照溶液的制備：參照1.2.1項制備不含丁香提取物的空白微乳，參照1.2.2(3)項稱取空白微乳20.00 g，制成陰性對照溶液。(5)薄層色譜鑒別：丁香酚對照品、對照藥材溶液各5 μL，供試品、陰性對照溶液各10 μL， 分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)- 乙酸乙酯(5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至105 ℃，置紫外燈(365 nm)下檢視。

1.2.3 丁香微乳的含量測定 (1)色譜條件:色譜柱為Welchrom C18(4.6 nm×250 nm，5 μm)，流速為 1 mL/min， 柱溫為40 ℃[8]，進樣量為20 μL，流動相為甲醇-水(55∶45)[9]，檢測波長為282 nm。(2)對照品溶液的制備:精密稱定丁香酚對照品0.027 5 g，置于25 mL的容量瓶中，定容至刻度，制成含丁香酚1.100 0 mg/mL的丁香酚對照品溶液。(3)供試品溶液的制備：取丁香微乳約3 g，精密稱定，加入50 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度線，搖勻，過濾即得[10]。(4)陰性對照溶液的制備：參照1.2.1項制備不含丁香提取物的空白微乳，參照1.2.3(3)項制備陰性對照品溶液。(5)專屬性試驗：分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液20 μL， 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。(6)線性關系的考察：精密量取1.2.3(2)項制備的對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL和0.6 mL置于10 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度。分別精密吸取20 μL注入液相色譜儀，并記錄峰面積。以進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。(7)精密度試驗：精密吸取濃度為0.033 0 mg/mL的對照品溶液20 μL， 分別進樣6次，記錄其峰面積并計算其RSD。(8)穩定性試驗：精密稱定丁香微乳3.006 3 g制成供試品溶液，在0、2、4、6、8、12 h和24 h進行檢測，計算其RSD。(9)重復性試驗：取同一批丁香微乳，參照1.2.3(3)項平行制備6份供試品溶液進行檢測，計算其含量的RSD。(10)加樣回收率試驗：分別取9份丁香微乳約1.5 g，精密稱定，分成3組，分別向每組中加入高、中、低3個濃度的丁香酚對照品溶液。分別進行含量測定，計算回收率及其RSD。(11)含量測定：分別取3批丁香微乳約3 g，精密稱定，制成供試品溶液，每批檢測3次，計算丁香微乳中丁香酚含量。

2 結果

2.1 丁香微乳的鑒別 在紫外燈(365 nm)下，丁香微乳色譜中，在與對照藥材或丁香酚對照品色譜相應的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾(圖1)。

圖1 丁香微乳薄層色譜圖Fig.1 TLC of Caryophylli Flos microemulsion1:空白微乳； 2:丁香微乳； 3:丁香對照藥材； 4:丁香酚對照品1:Blank microemulsion; 2:Caryophylli Flos microemulsion;3:The control herbs of Caryophylli Flos; 4:Standard eugenol

2.2 丁香微乳的含量測定

2.2.1 專屬性試驗 丁香微乳色譜峰中丁香酚與雜質峰分離良好，分離度大于1.5，理論塔板數不小于3 000，空白微乳對丁香微乳中丁香酚的測定無干擾(圖2和圖3)。

圖2 丁香微乳高效液相色譜圖Fig.2 HPLC of Caryophylli Flos microemulsion

圖3 空白微乳高效液相色譜圖Fig.3 HPLC of blank microemulsion

2.2.2 線性關系的考察 丁香酚在濃度0.011 0～0.066 0 mg/mL內呈良好線性關系(r=1.000 0)，線性擬合回歸方程為y=22 545 602.597 4x+30 256.800 0(圖4)。

圖4 丁香酚標準曲線Fig.4 The calibration curve of eugenol

2.2.3 精密度試驗 濃度為0.033 0 mg/mL的丁香酚對照品溶液，6次的峰面積分別為770 800、771 293、771 073、774 662、778 299和779 222，RSD為0.49%。說明儀器精密度良好。

2.2.4 穩定性試驗 丁香微乳溶液在0、2、4、6、8、12 h和24 h的峰面積分別為707 159、706 377、706 552、709 760、706 634、706 508和705 193，RSD為0.20%。說明丁香微乳溶液在24 h內穩定。

2.2.5 重復性試驗 在丁香微乳重復性試驗中，峰面積的RSD=0.56%(表1)，說明重復性良好。

表1 丁香微乳重復性試驗結果Table 1 The repeatability test results of Caryophylli Fols microemulsion

2.2.6 加樣回收率試驗 丁香微乳劑加樣回收率試驗中所測丁香酚的平均回收率是100.60%，其RSD=1.00%(表2)，說明準確性高。

表2 丁香微乳加樣回收率試驗結果Table 2 The recovery test results of Caryophylli Fols microemulsion

2.2.7 含量測定 丁香微乳中丁香酚含量3次測定結果分別為0.05%、0.049%、0.05%(表3)，平均含量為0.049 7%。

表3 丁香微乳中丁香酚含量檢測結果Table 3 The determination results of eugenol content in Caryophylli Flos microemulsion

3 討論

3.1 關于丁香微乳的薄層色譜鑒別 采用薄層色譜法鑒別中藥制劑時，樣品的制備和展開劑的選擇對待測斑點的集中性與其他斑點的分離度起重要作用[11]。本試驗在丁香微乳的薄層色譜鑒別中，參照戴建鋒[7]樣品前處理方法，將無水硫酸鈉加入丁香微乳中，超聲破乳，石油醚進行萃取，揮干石油醚，再加乙醚進行溶解。根據薄層色譜的分析技術原理[12]，本試驗所用展開劑，通過調節石油醚與乙酸乙酯的比例來改變展開劑的極性，在2015版獸藥典的展開劑的基礎上，增大展開劑的極性，最終確定使用石油醚(60～90 ℃)∶乙酸乙酯=5∶1作為丁香微乳薄層色譜鑒別的展開劑，丁香酚與相鄰物質的分離度更高，且斑點位于薄板中間位置，與丁香酚對照品相同位置處斑點清晰可見，且空白微乳無干擾。

3.2 關于丁香微乳的含量測定 中國獸藥典2015版二部采用氣相色譜法對丁香藥材中丁香酚含量進行測定[1]，而高效液相色譜法(HPLC)在中藥成分含量測定中逐漸得以廣泛應用。黎迎等[11]以甲醇-1%醋酸水(55∶45)為流動相，采用HPLC對丁香藥材中丁香酚進行了含量測定，結果表明HPLC法測定丁香中丁香酚的含量高于藥典氣相色譜法。陳岳蓉等[13]也采用HPLC測定了藏藥七味訶子散中有效成分丁香酚的含量。本試驗采用Welchrom C18色譜柱(4.6 nm×250 nm，5 μm)，以甲醇-水(55∶45)為流動相對丁香微乳中丁香酚含量進行測定，結果表明，丁香酚在0.011 0～0.066 0 mg/mL范圍內有良好線性關系(r=1.000 0)，平均回收率100.60%，RSD=0.99%。說明所建立方法專屬性強，重現性好，穩定準確。