高效液相色譜法測定雞肉中替米考星殘留的前處理方法比較

張珍珍，楊衛軍

(1.秦皇島市農產品質量安全檢驗監測中心，河北 秦皇島 066000 ；2.秦皇島市動物疫病預防控制中心 , 河北 秦皇島 066000)

替米考星(Tilmicosin，TIL)屬于半合成大環內酯類抗生素，臨床上主要用于治療家畜肺炎、家禽支原體病以及泌乳動物乳房炎等。人類長期食用替米考星殘留超標的動物源性食品，當體內蓄積的藥物濃度達到一定量時會損害前庭和耳蝸神經，導致眩暈和聽力減退，甚至可造成肝、腎的嚴重損害[1]，我國農業部第235號公告中規定替米考星在雞肉中的最高殘留限量不得超過75 μg/kg。

目前，雞肉中替米考星殘留的檢測方法通常選用農業部1025號公告—10—2008《動物性食品中替米考星殘留檢測 高效液相色譜法》[2]，在日常檢測中發現，由于雞肉組織中基質復雜，富含脂肪和蛋白質，采用農業部1025號公告—10—2008方法對豬肉樣品提取效果較好，而對雞肉樣品提取時，提取液容易呈渾濁狀態，直接進入固相萃取柱，會出現柱子堵塞，凈化效果不理想，在氮吹時由于脂肪的存在造成不易吹干、氮吹時間長等問題，從而導致目標化合物在前處理過程損失較多，回收率較低、不穩定，增大了殘留檢測的難度。因此，優化建立雞肉組織中替米考星殘留檢測的最佳樣品前處理方法，對檢測結果的可靠性至關重要。

1 材料與方法

1.1 儀器 U3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)，Synergy Millipore超純水器(法國默克密理博)，臺式高速冷凍離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)，IKA MS3 digital數顯旋渦混合器(德國艾卡)，ZD-85多用調速振蕩器(江蘇省金壇市醫療儀器廠)，SPT-24V氮吹儀(北京斯珀特科技有限公司)，FW100高速萬能粉粹機(天津泰斯特儀器有限公司)，XA205DU電子天平[梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司]。

1.2 試劑和耗材 替米考星標準品(純度83.47%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)，磷酸二氫鉀、二丁胺、磷酸、四氫呋喃、乙酸銨(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)，甲醇、乙腈、正己烷(色譜純，美國TEDIA公司)，Agilent Bond Elut C18固相萃取柱(6cc/500 mg，安捷倫科技有限公司)，3 mL一次性塑料滴管。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制 (1)標準儲備液(200 μg/mL)：稱取替米考星標準品約10 mg(按照標準品含量進行折算)，用乙腈溶解并定容至50 mL，置于4 ℃ 下避光保存。(2)標準中間液(20 μg/mL)：分別精密吸取標準儲備液1 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀釋并定容，4 ℃下避光保存。(3)標準工作液：取20 μg/mL替米考星標準中間液于容量瓶中，用流動相稀釋并定容，制成濃度為0.05、0.1、0.5、5.0 μg/mL和10.0 μg/mL的系列標準工作溶液，現用現配。(4)磷酸二氫鉀緩沖溶液、洗脫液(0.1 mol/L 乙酸銨甲醇-乙腈，20+80，v/v)、流動相(乙腈-四氫呋喃-1 mol/L二丁胺磷酸緩沖液，130+55+25，v/v/v)的配置參照農業部1025號公告—10—2008。

1.3.2 樣品的前處理 方法1：農業部1025號公告—10—2008。方法2：參照農業部1025號公告—10—2008中前處理方法，并進行優化，具體操作如下。

(1)樣品的提取:稱取(2.5±0.05) g樣品，置于50 mL具塞離心管中，加4.0 mL乙腈，渦旋混勻，中速振蕩10 min，10 000 r/min離心5 min，上清液轉入另一個50 mL離心管中。組織殘渣中依次加2.5 mL磷酸二氫鉀緩沖液和4.0 mL乙腈，渦旋混勻，中速振蕩10 min，10 000 r/min離心5 min，合并2次上清液，加乙腈飽和的正己烷10 mL，渦旋混勻30 s，10 000 r/min離心3 min，用一次性塑料滴管吸去上層正己烷層，下層加25 mL水，渦旋混勻，作為樣品提取液。

(2)樣品的凈化：將C18固相萃取柱置于固相萃取裝置上，依次用6 mL甲醇和6 mL水活化；取樣品提取液全部通過固相萃取柱，自然流干，再依次用6 mL 水和6 mL乙腈淋洗，擠干；用洗脫液5.0 mL洗脫，擠干，收集洗脫液；將洗脫液在50 ℃水浴中氮氣吹干。用1.0 mL流動相溶解殘渣，渦動30 s，放置10 min，期間渦旋混勻1次，經0.45 μm微孔濾膜過濾后作為試樣溶液，待高效液相色譜儀測定。

1.3.3 色譜分離條件 色譜柱：C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-四氫呋喃-1 mol/L 二丁胺磷酸緩沖液(130+55+25，v/v/v)；流速：1.0 mL/min； 檢測波長：290 nm；進樣量：50 μL；柱溫：30 ℃。

1.3.4 測定 分別取試樣溶液和相應濃度的標準工作液，作單點校準，按外標法以色譜峰面積定量計算。

1.3.5 結果計算與表述 雞肉組織中替米考星的含量X，以質量分數微克每千克(μg/kg)表示，按下式計算：

X=CSVA/AS/1 000m

式中：CS:標準溶液中替米考星的濃度，μg/mL；V:溶解試樣殘渣所用流動相體積，mL；A：試樣中替米考星的峰面積；AS：標準溶液中替米考星的峰面積；m：試樣質量，g。

2 結果

2.1 樣品前處理方法的優化 參照農業部1025號公告—10—2008的方法，將樣品前處理步驟進行優化，達到節省提取試劑、提高樣品前處理質量和效率的目的，2種樣品前處理方法比較如圖1。

圖1 2種前處理方法比較Fig.1 Comparison of two pretreatment methods

2.1.1 將樣品提取步驟中稱樣量由“5.0 g”改為“2.5 g”，進行減半，同時將提取液用量也相應減半(乙腈由“8 mL”改為“4 mL”，磷酸二氫鉀緩沖液由“5.0 mL”改為“2.5 mL”，水的總用量由“50 mL”改為“25 mL”)，從而減少試樣及提取液的用量，節省試劑。

2.1.2 將振蕩時間由“20 min”縮短為“10 min”，離心轉速由“3 500 r/min”提高至“10 000 r/min”，由于轉速的提高，將離心時間由“10 min”縮短為“5 min”， 從而減少樣品前處理時間。

2.1.3 在“合并2次上清液，加40 mL水”提取步驟中，將“水40 mL”改為“乙腈飽和的正己烷10 mL”，由于雞肉樣品含有脂肪影響提取效果，采用乙腈飽和的正己烷則可去除脂肪等干擾物，有利于進一步凈化，與水相比效果較好。

2.1.4 在樣品凈化過程中，將活化柱子的甲醇和水的用量、淋洗液中水和乙腈的用量均由“10 mL”減少至“6 mL”，與柱子本身的最大容量保持一致；將洗脫液的用量由“2.5 mL”改為“5.0 mL”，水浴溫度由“30 ℃”提高至“50 ℃”，從而既保證目標成分從固相萃取柱上徹底洗脫，又縮短了氮吹時間。

2.2 方法的檢出限 由于替米考星是順反異構體的混合物，因此，在色譜圖上存在順式異構體色譜峰和反式異構體色譜峰。標準品和陽性添加樣品中反式替米考星、順式替米考星分別在10 min和12 min 左右出峰，空白試料對所測分析物無干擾，在該色譜條件下反式替米考星、順式替米考星均得到很好的分離。根據樣品進行標準物質添加回收率試驗，以3倍信噪比可測得的最低質量濃度確定方法的檢出限為10 μg/kg；替米考星標準溶液色譜圖見圖2，空白組織的色譜圖及空白組織中添加100 μg/kg替米考星藥物的色譜圖見圖3～4。

圖2 替米考星標準溶液色譜圖(0.5 μg/mL)Fig.2 Chromatogram of tilmicosin standard solution(0.5 μg/mL)

圖3 空白樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of blank sample

圖4 加標樣品色譜圖(100 μg/kg)Fig.4 Chromatogram of spiked blank samples(100 μg/kg)

2.3 方法的準確度、重復性和精密度 采用標準添加法，在空白組織中分別設計高、中、低3個水平濃度添加(50、100 μg/kg和200 μg/kg)的替米考星標準溶液進行回收率測定，每個濃度設定6個平行樣品，同時進行空白試驗，替米考星回收率達到92.3%～98.6%，相對標準偏差(RSD)為0.59%～0.74%，加標回收率試驗結果見表1，由表1可知，不同濃度水平的添加，在雞肉組織中回收率均達到90%以上，表明該方法測量準確度高、重復性好。取處理好的同一試樣液注入液相色譜儀中，連續10次重復測定，計算出相對標準偏差(RSD)，精密度試驗結果見表2，由表2可知，其濃度的相對標準偏差為0.54%，表明本方法有較好的測量精度。

表1 雞肉中替米考星藥物添加回收率試驗結果Table 1 Results of spiked recoveries test of tilmicosin drug in chicken

表2 精密度試驗結果Table 2 Results of precision test

2.4 與農業部1025號公告—10—2008方法比較 2種樣品前處理方法及結果比較見表3。

表3 2種樣品前處理方法及結果比較Table 3 Comparison of two pretreatment methods and results

2.4.1 采用農業部1025號公告—10—2008樣品前處理方法，每提取1個樣品，需要71 mL提取液，僅振蕩和離心時間需要70 min；而優化后的方法則需要45.5 mL 提取液，振蕩和離心時間需要33 min。因此，與農業部1025號公告—10—2008方法相比，優化后的樣品提取步驟可以節省36%的試劑，縮短53%的提取時間。每凈化1個樣品，可節省試劑溶液13.5 mL；通過將水浴溫度由30 ℃提高到50 ℃，在不影響凈化效果的前提下，縮短氮吹時間約20 min。 同時，將提取液“水”更換為“乙腈飽和的正己烷”后，使雞肉樣品中脂溶性雜質進一步凈化，使提取液清亮且容易通過固相萃取柱，避免柱子堵塞等現象，在氮吹時容易吹干，顯著提高樣品中目標物的回收率及穩定性。

2.4.2 與農業部1025號公告—10—2008方法相比，結果顯示，雞肉中替米考星藥物添加回收率試驗中，同樣設置高、中、低3個水平濃度添加，其中樣品中添加50 μg/kg回收率為68.7%～70.4%(RSD=1.41%)，添加100 μg/kg回收率為72.5%～75.7%(RSD=1.86%)，添加200 μg/kg回收率為76.4%～80.6%(RSD=2.11%)；而采用優化后的樣品前處理方法時，3個水平濃度添加回收率均達90%以上(RSD<0.8%)，顯著提高了檢測結果的準確度及重復性。

4 結論

目前，雞肉中替米考星殘留的檢測方法通常選用農業部1025號公告—10—2008《動物性食品中替米考星殘留檢測 高效液相色譜法》。劉勇軍和姜艷彬(2012年)采用乙腈、水提取，3種添加濃度(0.05、0.10 mg/kg和0.15 mg/kg)回收率在73.1%～79.3%[1]；曹忠君(2014年)采用乙腈、磷酸二氫鉀緩沖液、水進行提取，樣品添加濃度為100 μg/kg時平均回收率為87.8%[3]；申惠敏和賈秀珍(2019年)綜述了高效液相色譜法檢測雞肉中替米考星，樣品采用乙腈、磷酸二氫鉀緩沖液、水進行提取[4]。

本試驗通過在農業部1025號公告—10—2008《動物性食品中替米考星殘留檢測 高效液相色譜法》基礎上對樣品前處理方法進行優化，建立了采用高效液相色譜法測定雞肉中替米考星的最佳樣品前處理方法，該前處理方法解決了農業部1025號公告—10—2008方法檢測雞肉樣品時，提取液容易呈渾濁狀態，直接進入固相萃取柱，堵塞柱子，凈化效果不理想，氮吹不易吹干、氮吹時間長，回收率較低、不穩定等問題，顯著提高了檢測結果準確度、重復性，為雞肉組織中替米考星的殘留分析提供了可靠的分析方法。