咖啡因在帕金森病小鼠模型中神經保護作用的轉錄組學分析

鄭余銀，馮藝佳，阮青青，屠文展

1.溫州醫科大學附屬第二醫院 康復醫學科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 神經內科，浙江 溫州 325015

帕金森病（Parkinson"s disease，PD）是世界上第二大神經退行性疾病，其主要臨床表征為靜止性震顫、肌肉僵直、運動遲緩，部分患者伴有焦慮、抑郁、記憶減退等精神類障礙[1]。左旋多巴胺藥物被廣泛應用于PD患者治療中，但該藥物對靜止性震顫無效，且會造成腸胃不適、惡心等不良反應，同時，長期服用左旋多巴胺的PD患者表現出對藥物不敏感，且伴隨易動癥[2-4]。因此，尋找新的用于緩解或治療PD的藥物具有重要的臨床和社會價值?？Х纫蚴强Х鹊闹饕钚猿煞种唬罅康牧餍胁W調查表明長期飲用咖啡可有效延緩PD的病理進程[5-7]。LUAN等[8]通過動物實驗發現，長期飲用咖啡因可有效減輕小鼠紋狀體由α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-Syn）聚集引起的細胞凋亡及炎癥反應，但咖啡因在PD病理進程中的保護機制尚不明確。本研究通過在小鼠海馬腦區注射α-Syn纖維體，模擬α-Syn在海馬腦區累積而引起的認知功能障礙，利用轉錄組學分析探討咖啡因緩解α-Syn造成認知功能受損的可能分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：10周齡雄性C57BL/6小鼠，體質量22～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司上海分公司，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2017-0011。飼養環境為（23±2）℃，12 h/12 h光照/暗周期。所有實驗動物操作規范均按照溫州醫科大學實驗動物管理規定進行。

1.1.2 試劑和儀器：α-Syn纖維體（No.SPR-317）購自加拿大StressMarq公司；咖啡因（Cat#C0750）和戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司；DAB試劑盒（abs957）購自上海Absin公司；α-Syn抗體（ab209538）購自英國Abcam公司；RNA提取試劑TRIzolTM（15596026）購自美國Thermo Fisher公司；cDNA反轉錄合成試劑盒（RR037A）購自日本Takara公司；SYBR Green試劑購自美國BIO-RAD公司；光學顯微鏡DFC7000 T購自德國Leica公司；腦立體定位儀（68507）購自深圳瑞沃德生命科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 α-Syn誘導的PD動物模型的建立：按照HU等[9]的方法，利用腦立體定位注射技術，將5 μg（溶于3 μL PBS溶液）α-Syn纖維體或同等體積的無菌PBS注射到10周齡雄性小鼠雙側海馬區（坐標：AP，-2.2 mm；ML，±1.5 mm；DV，-2.3 mm）。

1.2.2 分組與處理：根據LUAN等[8]的方法，將咖啡因溶于飲用水中（1 g/L）。實驗分為3組：PBS造模飲水組（PBS組，n=10），α-Syn造模飲水組（α-Syn組，n=9）和α-Syn造模咖啡因處理組（α-Syn-Caff組，n=10）。α-Syn造模后，連續3個月每天給予實驗小鼠咖啡因或水飲用。

1.2.3 α-Syn免疫組織化學染色：用二氨基聯苯胺法（DAB）進行α-Syn染色。α-Syn造模3個月后，每組3只小鼠進行深度麻醉（0.3%戊巴比妥鈉）；PBS及PFA灌注后取腦組織進行石蠟包埋并制備切片（30 μm）；腦片經2 h烘烤（55～60 ℃）、梯度乙醇水化、抗原修復后，滴加3% H2O2，室溫孵育10 min，PBS洗3次；5%羊血清封閉30 min后，滴加α-Syn抗體，4 ℃過夜；PBS洗3次，用DAB試劑顯色后，進行蘇木素復染、脫水、二甲苯透明及封片，顯微鏡下進行觀察拍攝。

1.2.4 Y迷宮實驗：Y迷宮實驗用于檢測小鼠的工作記憶，將實驗小鼠放置于Y迷宮的A臂，記錄5 min內小鼠在Y迷宮中的進臂順序。如：A-B-C，AC-B記為正確順序，A-B-A或A-C-A記為錯誤順序。統計正確率來評估小鼠的工作記憶能力[10]。

1.2.5 轉錄組測序分析：Y迷宮實驗后，小鼠麻醉（0.3%戊巴比妥鈉）并用PBS灌注后，于冰板上迅速分離海馬組織，液氮速凍后-80 ℃保存。利用TRIzol法提取總RNA，A260/280=1.9～2.0符合建庫要求，并送至北京諾禾致源技術有限公司進行轉錄組測序及后續生物信息學分析[差異基因篩選標準：log2（fold change）＞1.3]。

1.2.6 熒光定量PCR（qPCR）：對應樣本的RNA（1 μg）經反轉錄合成cDNA。利用SYBR-Green法進行熒光定量，檢測目的基因的轉錄表達水平。各基因qPCR的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統計學處理方法 采用Graphpad 5.0軟件進行分析。計量資料采用±s表示，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 長期飲用咖啡因有效改善α-Syn引起的工作記憶障礙 DAB染色觀察α-Syn的聚集情況。α-Syn蛋白在造模飲水組小鼠海馬腦區有明顯聚集，呈胞體樣結構，證明造模成功。相較于α-Syn組，α-Syn-Caff組小鼠的α-Syn聚集明顯較少，見圖1A。Y迷宮實驗結果發現，相較于PBS組小鼠，α-Syn造模后，小鼠在Y迷宮中的進臂順序正確率明顯下降（P＜0.05），表明其工作記憶表現能力受損；而α-Syn-Caff組相較于α-Syn組，其工作記憶能力有顯著改善（P＜0.05），見圖1B。

圖1 咖啡因改善α-Syn誘導的工作記憶障礙

圖2 α-Syn蛋白引起海馬腦區小膠質細胞活化

2.2 α-Syn蛋白促進海馬腦區小膠質細胞的活化 通過轉錄組分析發現：相對于PBS組，α-Syn組在轉錄水平上有431個基因顯著上調（P＜0.05），232個基因下調（P＜0.05），見圖2A。經KEGG聚類分析后發現：差異基因主要集中在破骨細胞分化、細胞內吞及趨化反應等信號通路，見圖2B。在α-Syn組的轉錄表達譜中，Tmemll9和Cx3crl表達水平顯著升高（P＜0.05），隨后用qPCR驗證了這一結論；此外，Trl9在α-Syn組也呈現高表達（P＜0.05），見圖2C。

2.3 長期飲用咖啡因增強神經元和膠質細胞的增殖能力 在對α-Syn組和α-Syn-Caff組進行轉錄組差異基因分析，發現有363個基因上調（P＜0.05），277個基因下調（P＜0.05），見圖3A。我們對這些差異基因進行KEGG聚類發現：只有趨化因子信號顯著上調（P＜0.05），這說明咖啡因可能增強了對病變周圍免疫細胞的招募，對損傷組織進行修復（見圖3B）。但是，咖啡因對α-Syn引起的小膠質細胞分化、內吞作用及免疫調節均無顯著改善。因此，我們對差異基因進行GO注釋分析，結果發現：相對于α-Syn組，α-Syn-Caff組富集的功能注釋主要集中在細胞增殖（包括干細胞、神經前體細胞和膠質細胞）和調節突觸傳遞方面，見圖3C。我們對參與細胞增殖的關鍵基因Sox2和VEGFA進行了qPCR驗證，發現咖啡因飲用可以顯著誘導Sox2和VEGFA轉錄表達（P＜0.05），見圖3D。

3 討論

研究表明α-Syn纖維體被神經元吸收，誘導正常的內源性α-Syn向其聚集，從而形成包涵體并在大腦中呈現朊病毒樣擴散。異常聚集的α-Syn可通過氧化應激、細胞毒性等方式造成神經元的損失[11-12]。LUK等[13]在腦區注射α-Syn纖維體模擬PD的認知障礙和運動障礙。本研究選擇海馬注射α-Syn纖維體模擬PD的病理特征及認知功能缺陷表型，來探討咖啡因的認知功能保護作用機制。

圖3 長期飲用咖啡因有效增強細胞增殖能力

部分PD患者在運動癥狀之前就表現出明顯的認知功能障礙，這可能與α-Syn在腦內的擴散方式有關。當α-Syn擴散并異常聚集在參與認知的腦區或神經元時，伴隨著神經元的退行性病變，認知能力會逐漸下降。在模型中，在海馬神經元注射α-Syn 3個月后，α-Syn蛋白在該腦區大量聚集，小鼠表現出明顯的認知缺陷；而飲用咖啡因后α-Syn的聚集大量減少，且有效緩解其造成的工作記憶能力損傷。這一結論與LUAN等[8]和HU等[9]在紋狀體腦區注射α-Syn并給予咖啡因處理的結果相一致，進一步證明了咖啡因對PD認知功能的保護作用。

在中樞神經系統中，小膠質細胞的活化，尤其是促炎M1型的分化是PD病理的主要變化之一。一直以來，關于α-Syn促進小膠質細胞活化的分子機制是PD的研究熱點之一。小膠質細胞的激活及促炎因子的釋放一直被認為是神經退行性病變的共同病理表現。大多數觀點認為：小膠質細胞的活化是由于α-Syn、Aβ或Tau蛋白等異常聚集引起的[14-16]。有研究指出α-Syn可通過與小膠質細胞表面的TLR受體相互作用來激活膠質細胞[17]。近期的多巴胺神經元移植實驗表明，α-Syn引起的小膠質細胞活化可能參與了PD病理的發生發展，小膠質細胞在α-Syn病理性聚集及傳播中發揮了重要的作用[18]。Tmem119是小膠質細胞活化的標志物，在活化的小膠質細胞中高表達[19]。本研究發現咖啡因飲用可有效降低Tmem119的轉錄水平（P＜0.05）。這暗示著咖啡因可有效減輕α-Syn引起的小膠質細胞活化及炎癥反應。隨著對Tmem119操控技術的發展[20]，抑制Tmem119可能是潛在的有效緩解PD的治療策略。

ALE-AGHA等[21]研究發現，在皮膚受到紫外線損傷時，咖啡因會促進細胞的DNA修復；咖啡因還可以促進p27蛋白（細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B）向線粒體的轉運，從而增強心臟細胞的抗損傷能力。另有研究發現，給予小鼠適量的咖啡因，可促使衰老小鼠的心肌功能得到極大改善，同時加快心肌受損后的修復[22]。在轉錄組分析中發現，咖啡因的主要功能也是富集在促細胞增殖信號通路。這說明在PD的病理進程中，咖啡因的保護作用可能正是增強了神經元及其他類型細胞的修復及增殖能力來對抗α-Syn的損傷作用。

本研究通過轉錄組分析發現咖啡因可有效改善海馬腦區的小膠質細胞的炎癥反應，增強細胞的增殖能力，并改善小鼠的認知功能障礙，為闡明咖啡因對PD的保護機制提供了新證據。