含高濃度透明質酸移植液對IVF-ET臨床結局的影響

李瑞岐，區頌邦，廖早文，林海燕，李迪，張清學，王文軍*

(1.中山大學孫逸仙紀念醫院生殖內分泌專科，廣州 510120；2.喀什地區第一人民醫院生殖醫學中心，喀什 840000)

透明質酸(Hyaluronic acid，HA)是一種非硫酸化的糖胺聚糖聚合物，天然存在于許多哺乳動物組織細胞外基質和細胞間質中，也是女性生殖道中含量最豐富的大分子之一[1]。EmbryoGlue是一種專用于胚胎移植的富含HA(0.5 mg/ml)的試劑。一些臨床研究顯示，EmbryoGlue作為移植液，可提高胚胎植入率和臨床妊娠率[2-4]。一些臨床研究結果并不支持該結論[5-7]。使用富含HA的培養基作為移植液的臨床效果，在國內外仍存在較大爭議。因此，為進一步明確EmbryoGlue對胚胎移植患者臨床結局的影響和使用范圍，本研究回顧性分析了在同一時間段內使用EmbryoGlue(Vitrolife，10085，瑞典)或者G2囊胚培養基(Vitrolife，10132，瑞典)作為移植液進行胚胎移植的患者的臨床結局。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2018年8月至2019年1月在中山大學孫逸仙紀念醫院行IVF助孕的患者臨床資料。納入標準：(1)女方年齡≤45歲；(2)新鮮胚胎移植周期或者FET周期；(3)胚胎移植液為EmbryoGlue或者G2培養基。排除標準：二步移植周期、晚補救ICSI周期、移植日胚胎質量未達到可用胚胎標準的周期。

本研究共納入符合標準的患者胚胎移植資料1 207個周期，根據所用移植液不同分為EmbryoGlue組(n=596)和G2組(n=611)。

二、研究方法

1.胚胎培養：本研究所有患者的配子和胚胎均使用Vitrolife公司G5系列培養基進行體外受精和胚胎培養。受精當天(D0)患者配子以及ICSI后的卵母細胞均培養在G-IVF培養基中過夜培養。取卵第2天(D1)將受精卵轉移至平衡過的G1培養基培養至D3。如果進行囊胚培養，則在D3時將胚胎移入平衡過的G2培養基培養至D5或者D6。D0至D3培養環境為37℃、6%CO2、飽和濕度培養箱。囊胚培養時，培養環境為37℃、6%CO2、5%O2飽和濕度培養箱。

2.胚胎解凍：本研究所有冷凍液和解凍液分別為玻璃化冷凍液(加滕，VT101，日本)和玻璃化解凍液(加滕，VT102，日本)。胚胎解凍前預熱1號解凍液至37℃，2～4號解凍液平衡至室溫。解凍時將裝有胚胎的載桿從液氮拿出后快速摔下載桿上的液氮，并迅速將載桿的前端浸入1號解凍液，1 min后將胚胎分別轉移至2～4號解凍液，停留時間分別為3 min、5 min、5 min。結束后，將胚胎培養至G2培養基，觀察胚胎存活情況并評分。在胚胎移植開始前1 h，挑選所要移植的胚胎至移植液(EmbryoGlue或G2)中。

3.觀察指標：臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%，胚胎種植率=孕囊數/移植胚胎數×100%，活產率=活產周期數/移植周期數×100%，流產率=流產周期數(包括異位妊娠)/臨床妊娠周期數×100%。

四、統計方法

結 果

一、兩組患者的基本臨床資料及妊娠結局比較

本研究共納入1 207個胚胎移植周期，EmbryoGlue組和G2組分別為596和611個周期，除EmbryoGlue組的胚胎移植數顯著低于G2組(P<0.05)外，兩組患者的其他基本臨床資料以及臨床妊娠結局比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的基本臨床資料及妊娠結局比較[(-±s)，%]

二、行卵裂期胚胎移植的兩組患者基本情況及妊娠結局比較

患者中行卵裂期胚胎移植的共有836個周期，EmbryoGlue組和G2組的周期數分別為408和428個周期。兩組患者基本資料除移植胚胎數[(1.84±0.50)vs.(1.87±0.46)](P<0.05)外，其他基本資料比較均無統計學差異(P>0.05)；兩組患者的臨床妊娠率、胚胎種植率、活產率以及流產率無論是在新鮮周期還是FET周期，差異均無統計學意義(P>0.05)(表2)。

表2 卵裂期胚胎移植的兩組患者基本情況及妊娠結局[(-±s)，%]

三、EmbryoGlue對囊胚移植妊娠結局的影響

患者中行囊胚移植的共有371個周期，EmbryoGlue組和G2組的周期數分別為188和183個周期，兩組患者的一般資料差異均無統計學意義(P>0.05)；新鮮周期囊胚移植的周期數較少(n=65)，各項臨床結局觀察指標均無顯著性差異(P>0.05)；FET周期囊胚移植的結果顯示，EmbryoGlue組的臨床妊娠率和種植率均顯著高于G2組(P<0.05)，EmbryoGlue組的活產率雖然高于G2組，但差異尚未達到統計學意義(P>0.05)，兩組間的流產率無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 囊胚移植的兩組患者基本情況及妊娠結局[(-±s)，%]

四、EmbryoGlue對FET周期妊娠結局影響的Logistic回歸分析

通過logistic回歸分析，對可能影響FET囊胚移植臨床結局的因素進行校正分析。結果顯示，在校正女方年齡、治療周期數、移植胚胎數、移植優胚數以及是否自然周期移植因素后，EmbryoGlue對臨床妊娠率的影響仍然具有統計學意義(P=0.034)，對種植率和活產率的影響均無統計學意義(P>0.05)(表4)。

表4 FET周期臨床結局影響因素的多因素回歸分析

討 論

EmbryoGlue在IVF領域中已應用多年，但是其臨床作用一直存在爭議。早期有研究顯示，EmbryoGlue有利于D3和D5新鮮胚胎移植的臨床結局，尤其是對于高齡和胚胎質量較差以及有過胚胎著床失敗史的患者，可以獲得較好的臨床妊娠率[3，8]。吳芳等[9]的研究結果也顯示，使用EmbryoGlue作為移植液可以提高IVF-ET的妊娠率和種植率。而有的研究結果則相反[6，10]。本研究結果顯示，EmbryoGlue作為移植液可以改善FET周期囊胚移植的臨床結局。但是對于D3卵裂期胚胎，EmbryoGlue未改善其臨床結局，與其他研究報道結果一致[11]。另外，我們還進一步分析了新鮮移植周期和FET周期的臨床結局，結果無論是新鮮移植還是FET移植，EmbryoGlue同樣未改善卵裂期胚胎移植的臨床結局。

劉輝等[5]在其研究中指出，EmbryoGlue作為移植液并不能改善D2、D3和D5胚胎移植的臨床結局，在D3移植組中，EmbryoGlue組的活產率反而要低于G2組，流產率顯著高于G2組。張克榮等[12]的研究結果顯示，EmbryoGlue可以改善卵裂期移植周期的臨床妊娠率，但是其研究中未納入流產率的觀察指標。Hambiliki等[13]的研究結果顯示，EmbryoGlue能夠提高卵裂期胚胎FET周期的胚胎種植率，但是存在較高的流產率和生化妊娠率，以至于最終的活產率相似。同樣，最近王致輝等[14]的研究也顯示，EmbryoGlue用于卵裂期胚胎移植時也存在較高的流產率。在本研究中，對于卵裂期胚胎而言，盡管EmbryoGlue組的流產率與G2組相似，但是對于臨床結局而言，EmbryoGlue并未表現出任何優勢，反而G2組的臨床觀察指標要稍好于EmbryoGlue。提示在卵裂期胚胎移植時選擇G2作為移植液可能更為合適。原因可能是由于 EmbryoGlue 中富含的透明質酸雖然增強胚胎與子宮內膜之間的附著，但是也抑制了胚胎在宮腔的游走，阻止了卵裂期胚胎選擇合適的種植位點，導致胚胎種植后引發早期流產[15]。

另外，在哺乳類動物的卵泡、輸卵管、子宮黏液中都存在HA。有研究表明，HA在小鼠胚胎著床期被大量表達[16]，同時HA的主要受體CD44在小鼠囊胚滋養層和內細胞團細胞，以及植入期子宮內膜的基質中高表達，并且在人的子宮內膜中也有類似的發現[17]，表明HA對胚胎種植非常重要。Wang等[11]通過比較卵裂期和囊胚期胚胎中兩個主要的HA受體的表達水平，發現CD44和透明質酸介導的運動受體(RHAMM，也稱為細胞內透明質酸結合蛋白，IHABP)在囊胚中的表達水平顯著高于8-細胞期胚胎。由此以上研究可以推斷，在移植液中添加透明質酸有利于囊胚期胚胎和子宮內膜間的相互作用，誘導胚胎著床。而對于卵裂期胚胎移植，HA的添加可能為時過早，作用效果不大。本文研究的臨床結果也與此相一致。

總之，本研究結果顯示，EmbryoGlue未改善新鮮周期和FET周期的卵裂期胚胎移植結局，但是可以改善FET囊胚移植的臨床結局。是否能夠改善新鮮囊胚移植周期的臨床結局還需要大樣本量的臨床研究進行證實。