孕前擴展性單基因病攜帶者篩查的臨床應用研究

趙瓊珍，康蘇，張兆肖，劉若男，袁琳琳，黃衛東

(新疆佳音醫院，烏魯木齊 830000)

隨著全球對不孕癥認識的提高，生殖專家持續對治療方法進行改進發展。孕前擴展性攜帶者篩查(Preconception expanded carrier screening，PECS)用于檢測攜帶致病變異或突變基因的健康個體。如果夫妻雙方都攜帶同一基因的致病變異，或者女性攜帶X-連鎖隱性疾病相關的致病變異，夫妻生育患兒的風險就會增加。欲使用輔助生殖技術(ART)的夫婦可以選擇PECS，以獲知他們的生殖潛力，并在尋求治療之前選擇更好的策略。特別是，PECS可以幫助患者和臨床醫生確定一對夫婦是否需要進行胚胎植入前單基因病遺傳檢測(PGT-M)，降低子女患單基因遺傳病的發病風險。據估計，目前全世界每10 000名兒童中就有30人受到遺傳疾病的影響[1]。根據在線人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM)，有報道2 933個X-連鎖和常染色體隱性遺傳單基因病[2]。這些疾病具有相對較高的攜帶頻率，促使美國婦產醫師協會(ACOG)和美國醫學遺傳基因組學會(ACMG)創建臨床指南，對孕前夫婦遺傳風險評估和如何適當篩選患者向醫生提供建議[3]。最初，遺傳性單基因病攜帶者篩查側重針對特定族裔人群，例如高加索人的囊性纖維化和非洲的鐮狀細胞貧血[4]。如今，通過高通量基因分型和測序，擴展性攜帶者篩查已發展為適用于泛族群，并擴大了檢測范圍[5]。盡管PECS的應用獲得了多種好處[6-7]，臨床醫生對基因組數據的解釋仍然是一個挑戰[8]。變異解釋、臨床相關性、標準化實踐、經濟敏感性和社會影響是現代相關從業者所面臨的持續挑戰[7，9]。由于這些問題引起的臨床偏好的可變性，ACOG或ACMG指南指出PECS是可以接受的，但每個臨床依據或實踐都應建立產前篩查的標準方法[3，10]。此外，由于缺乏標準化，世界某些地區幾乎不實施遺傳病攜帶者篩查。但在許多民族不同人群中使用PECS可以增加對各種遺傳病攜帶者狀態的檢測，并迅速提高專業水平，從而支持更廣泛的臨床應用[3，10]。

本研究旨在評估新疆佳音醫院不孕不育夫婦的PECS結果，更好地了解常染色體隱性遺傳病和X-連鎖遺傳病基因的攜帶率。另外，這項研究將評估新疆地區人口中高風險夫婦檢出率(“高風險夫婦”定義為夫婦為同一致病基因的攜帶者)。研究結果將有利于擴展新疆人群特有的遺傳風險的臨床認知。此外，可以增進對生殖遺傳學的認識，并有助于優化早期檢測方法以防止遺傳病的發生。因此，我們期望這項研究能更好地促進不孕不育夫婦的生殖咨詢和決策。

材料和方法

一、研究對象

回顧性分析2019年11月至2020年5月于新疆佳音醫院所有接受PECS的ART患者資料。分析PECS panel所檢測遺傳疾病的總體攜帶情況，以及各族群的攜帶率。

二、方法

1.PECS受檢者：來我院進行ART治療的不育患者均于ART治療前經過孕前遺傳咨詢后接受PECS，年齡20～55歲，包括漢族、維吾爾族、回族、哈薩克族和其他民族。充分告知患者檢測手段、局限性及可能存在的風險。本研究通過倫理審查，患者自愿接受PECS，采血前均已簽署知情同意書。

2.PECS panel：PECS針對中國常見的遺傳病如遺傳性耳聾、β地中海貧血、苯丙酮尿癥、進行性假肥大性肌營養不良、血友病、肝豆狀核變性在內的多種常見遺傳病，和《中國罕見病參考名錄》中收錄的白化病、代謝病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥等致病基因明確、遺傳方式主要為隱性的單基因遺傳病，以及ACMG推薦的新生兒及兒童遺傳代謝病等在內的206種遺傳病。

3.檢測方法：采集患者5 ml血液，用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技)提取DNA。文庫構建按照Ion Plus Fragment Library Kit V3(Thermo，美國)說明書進行。采用Qubit 3.0 Fluorometer(Thermo，美國)測定文庫濃度。使用Illumina Novaseq 6 000高通量測序平臺進行全外顯子組基因測序檢測，Sanger測序方法進行驗證。

4.檢測結果咨詢：對檢測出的陽性攜帶者進行遺傳咨詢。被檢出的高風險夫婦建議使用產前診斷和/或胚胎植入前單基因病遺傳檢測(PGT-M)以避免疾病遺傳。

5.觀察/分析指標：PECS panel單基因病相關變異的總體檢出情況(包括最常見的致病基因攜帶種類)；族群/性別的攜帶率差異。

三、統計學分析

應用R語言統計分析軟件對數據進行處理分析。chisq.test(data)程序進行統計，P<0.05表示差異有統計學意義。根據性別和民族來計算各亞群的攜帶者狀況。

結 果

一、患者一般資料

共有1 777例受檢者(包括812對夫婦)在進入ART治療前接受了PECS。受檢人群年齡20～55歲，平均年齡(33.5±4.9)歲，主要包括漢族、維吾爾族、回族、哈薩克族和其他民族。

二、總檢出情況

單基因病總攜帶率18.23%(324/1 777)，除10例為純合突變、1例為雜合突變外，其余均攜帶至少一種與常染色體隱性雜合變異；其中，66.67%(n=216)攜帶1種基因變異，24.07%(n=78) 攜帶2種基因變異，5.86%(n=19)攜帶3種基因變異，2.47%(n=8)攜帶4種基因變異，0.62%(n=2) 攜帶5種基因變異。在我們的研究中，無受檢者攜帶超過5種變異的情況。在研究人群中共鑒定出了106個基因中的240個致病變異體。

三、族別/性別的攜帶率差異

受檢者中女性915例，女性群體的平均年齡為(33.5±4.9)歲，其中174例為至少一個條件的攜帶者(19.02%)，741例(80.98%)為陰性；男性受檢者862例，平均年齡為(34.21±5.08)歲，其中149例(17.29%)被發現是至少一個條件的攜帶者，713例(82.71%)為陰性。女性攜帶率19.02%(174/915)，男性攜帶率17.29%(149/862)，性別間無統計學差異(P>0.05)。

受檢者中漢族1 103例、維吾爾族441例、回族91例、哈薩克族74例、其他民族68例；各族群的攜帶率從16.68%～22.06%不等，族群間攜帶率無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 不同民族致病基因攜帶率[n(%)]

四、PECS panel常見攜帶基因

PECS panel上分析的206種遺傳病的294個不同基因中，最常見的相關疾病列表如表2所示。檢出血色素沉著癥1型(HFE基因)3.88%(69/1 777)，是受檢人群中最常見的變異，其次是常染色體隱性耳聾1A型(GJB2基因)3.38%(60/1 777)、Gilbert綜合征(UGT1A1基因)1.74%(31/1 777)、囊性纖維化(CFTR基因)0.96%(17/1 777)和Krabbe病(GALC基因) 0.90%(16/1 777)等(表2)。

表2 PECS panel檢出前9種致病基因[n(%)]

五、不同族群的基因變異檢出情況

不同族群的攜帶者狀況中，漢族至少攜帶一種基因突變的攜帶率為19.04%(210/1 103)，維吾爾族為22.90%(101/441)、回族為20.88%(19/91)、哈薩克族為34.70%(17/74)，其他民族為16.18%(11/68)(表3)。

表3 不同民族主要基因變異檢出情況[n(%)]

六、夫妻雙方同時檢測結果

812對夫婦接受了PECS，46對(5.67%)檢出攜帶同一致病變異的高風險夫婦；其中，13對(28.26%)血色素沉著癥1型(HFE基因)，12對(26.09%)常染色體隱性耳聾1A型(GJB2基因)，5對(10.87%)Gilbert綜合征(UGT1A1基因)，3對(6.52%) Krabbe病(GALC基因)，2對(4.35%)苯丙酮尿癥(PAH基因)，2對(4.35%)囊性纖維化(CFTR基因)。經過遺傳咨詢，46對高風險夫婦中的13對(28.26%)選擇使用PGT-M篩選出不攜帶相關單基因病的胚胎。

討 論

高通量測序技術的進步可以同時檢測多個基因，大大降低了PECS成本。同時隨著ART治療的進步，特別是PGT-M的應用，部分國外生殖中心已常規應用PECS技術，提高助孕成功率。目前，我國國內臨床針對遺傳性疾病篩查的咨詢能力不足，大眾人群對攜帶者篩查認知度低，孕前人群優生優育觀念不足，基于以上原因，國內尚無PECS的臨床應用的報道[11-12]。

據報道，孟德爾遺傳疾病占嬰兒死亡率的近20%，在發達國家住院率高達18%[13]。新疆乃至整個中國還沒有對人群中多個隱性遺傳病攜帶者的患病率和發病率進行報道。目前為止，國內尚沒有一個經多學科組織批準的標準化指南，用于建議ART治療的患者是否進行遺傳病攜帶者篩查。

本研究為新疆佳音醫院生殖中心就診的患者提供孕前PECS，并遵守美國婦產醫師協會(ACOG)和美國醫學遺傳基因組學會(ACMG)目前的實踐指南[14-15]。第一次分析了在新疆不孕不育人群中多個隱性遺傳疾病的攜帶者狀況，從而有利于在ART治療中指導患者更好地做出生殖決策，以降低遺傳病的發生率。

本項研究中，總體研究人群中至少有1種常染色體隱性致病變異的檢出率是18.23%(324/1 777)。Franasiak等[16]于2016年對6 643名受檢者進行了PECS，檢測出攜帶率為25.10%。已發表的研究和我們的分析結果有所不同，可能源于所分析的群體、使用的不同遺傳病攜帶panel以及平臺的差異[17]。

本研究基于PECS結果分析，評估接受ART治療的夫婦懷上一個常染色體或X-連鎖疾病患兒的風險。分析表明，受檢夫婦中攜帶同一基因突變的比例為5.67%。Franasiak等[16]報告高風險不孕夫婦的頻率為0.20%。西班牙團隊利用NGS技術在輔助生殖人群中進行遺傳病攜帶者篩查中發現138對ART夫婦中有7對夫婦(5.07%)攜帶同一基因的突變(涉及6種遺傳病)[18]。在分析不同民族的攜帶者狀況中，新疆地區不同民族受檢者的總攜帶率及其攜帶致病基因種類均有差異。

本研究中，發現812對夫婦中46對(5.67%)為高風險不孕夫婦，其中檢出最高者是血色素沉著癥1型(HFE基因)28.26%(13/46)，其次是常染色體隱性耳聾1A型(GJB2基因)26.09%(12/46)、Gilbert綜合征(UGT1A1基因)10.87%(5/46)。所有這些高風險夫婦都需要進行臨床遺傳咨詢以及生殖選擇咨詢。檢測結果有利于臨床醫生進行更個性化的遺傳咨詢，以使患者充分知情并做出符合患者價值的生殖選擇[19-20]。

此外，本研究中使用的擴展性攜帶者篩查panel使用了二代測序技術(next generation sequencing)，這是目前有效的檢測平臺[11，17，21]。該panel針對多個民族群體基因測序，而非針對特定的族裔群體。一些研究人員證明，在使用擴展性攜帶者篩查而不是針對特定族裔的panel時，傳統的族裔/民族標簽幾乎沒有或根本沒有價值[22-23]，應向所有個人提供擴展性攜帶者篩查[24-25]。因此，在生殖醫療之前，建議根據孟德爾疾病的地區性流行和嚴重程度，考慮對夫婦雙方進行孕前遺傳病攜帶者篩查和遺傳咨詢。