五氯硝基苯亞急性暴露對卵巢甾體激素合成的影響

李雯，駱海燕，淡清華，鄶艷榮，高小博，陸彩玲*

(1.國家衛生健康委科學技術研究所遺傳優生中心，北京 100081；2.北京協和醫學院研究生院，北京 100730)

卵巢作為雌性哺乳動物的性腺，其主要功能是分泌甾體激素及排卵。孕酮和E2作為卵巢組織分泌的主要甾體激素，其合成及分泌在女性月經周期、卵泡發育、生殖妊娠等過程中均發揮著重要的調節作用。類固醇激素合成急性調節蛋白(Steroids acute regulatory synthesis protein，StAR)是甾體激素合成的限速酶之一，它能夠將細胞質中游離的膽固醇轉移到線粒體內膜中，這是甾體激素合成的初始步驟[1]。在膽固醇側鏈裂解酶(Cytochrome P450scc enzyme，P450scc)的作用下，進入線粒體后的膽固醇被轉化為孕烯醇酮，后者經過3β-羥甾脫氫酶(HSD3b)、細胞色素P450c17a酶(CYP17a1)等一系列酶的催化可生成孕酮及雄烯二酮等激素，其中雄烯二酮可在芳香化酶(Aromatase)的作用下轉化為E2[2]。卵巢內甾體激素的合成是一系列甾體激素合成酶綜合調控的過程，這一過程易受到環境因素如農藥、增塑劑、香煙煙霧等的干擾，從而導致激素合成及分泌異常，造成卵巢早衰、生育力下降等不良后果[3-5]。

五氯硝基苯(Pentachloronitrobenzene，PCNB)，又稱氯喹(Quintozene)，是一種常見的有機氯農藥，常用于農作物、中草藥的種植過程及城市中花卉、草坪等的病害防治，使用范圍廣泛[6]。PCNB化學性質穩定、半衰期長，使用后可在土壤、水體中長期殘留[7]。人體可通過飲食、飲水、皮膚接觸等多種方式接觸PCNB，人群暴露風險高[8]。PCNB可造成肝臟損傷，且具有潛在的致癌性[9]。另外有研究發現，PCNB及其代謝產物可穿過胎盤屏障，小鼠妊娠期PCNB暴露可導致子代腎臟發育不全、腭裂，并增加胎兒死亡率[10]。Metcalfe等[11]在對日本青鳉魚的研究中發現，PCNB暴露可導致受精卵發育異常，造成眼部畸形、大腦發育遲緩等不良后果。作為一種常見的環境污染物，目前國內外對PCNB的研究主要集中在殘留物檢測、降解等方面，對生殖系統尤其是卵巢功能影響方面的研究不多。我們實驗室前期研究發現，PCNB連續暴露7 d可降低大鼠血清孕酮水平、增加生長卵泡比例，表明PCNB可影響正常卵巢功能[12]。亞急性暴露指≤30 d的重復染毒，在毒理學中常用于研究相對有限時間內反復暴露某一毒物對生殖系統等的影響[13]。本研究在前期研究的基礎上通過對3周齡雌性SD大鼠連續PCNB亞急性暴露28 d，初步探討PCNB亞急性暴露對雌性大鼠甾體激素合成的影響。

材料與方法

一、實驗動物

3周齡雌性SD大鼠，體重(40±5)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證：SCXK(京)2016-0006，飼養于國家衛生健康委科學技術研究所SPF級實驗動物中心，飼養環境溫度(24±2)℃，濕度50%～70%，光照12 h明暗交替，提供充足的糧食和水、自由進食。所有實驗均通過國家衛生健康委科學技術研究所動物倫理委員會批準(倫理批號：2016-017)。

二、主要試劑及儀器：PCNB(Sigma，美國)，玉米油(阿拉丁，中國)，孕酮測定試劑盒、E2測定試劑盒(Roche，瑞士)，BCA蛋白定量試劑盒(Thermo，美國)，StAR兔多克隆抗體、Aromatase兔多克隆抗體(ABclonal，美國)，P450scc兔多克隆抗體(Cell Signaling，美國)，β-actin小鼠單克隆抗體(Sigma，美國)，辣根過氧化物酶-山羊抗兔IgG抗體、辣根過氧化物酶-山羊抗小鼠IgG抗體(中杉金橋)；超聲波細胞粉碎機(Branson SLP，美國)，全自動酶標檢測儀(Biotek，美國)。

三、研究方法

1.動物分組及PCNB亞急性暴露：將3周齡雌性SD大鼠30只隨機分成3組：給予50 mg·kg-1·d-1PCNB灌胃給藥的為低劑量組，給予100 mg·kg-1·d-1PCNB灌胃給藥的為高劑量組，給予等體積玉米油灌胃的為對照組，每組10只，連續灌胃28 d。灌胃期間每日對大鼠進行稱重并記錄，同時對大鼠毛發、粘膜和自主活動等一般情況進行觀測并記錄。

2.組織取材：末次染毒24 h后通過陰道涂片觀察大鼠發情周期，于發情間期對大鼠進行麻醉，取靜脈血后將大鼠安樂死，分離雙側卵巢組織，置生理鹽水中漂洗，剔除周圍脂肪組織、稱重并計算卵巢系數，卵巢系數=卵巢濕重/體重×100%。之后迅速將一側卵巢組織放入10%中性福爾馬林中固定，另一側放入液氮中冷凍備用。

3.血清E2、孕酮濃度測定：收集大鼠靜脈血于采血管中，室溫靜置一段時間后2 500g離心15 min，移取血清于1.5 ml EP管中，置于-80℃冰箱保存待測。利用孕酮、E2檢測試劑盒檢測血清孕酮和E2水平，實驗步驟嚴格按照說明書進行。

4.卵巢組織蛋白質提取及定量：大鼠灌胃28 d后，于發情間期處死，取大鼠卵巢組織，將組織剪碎后加入組織裂解液及蛋白酶抑制劑，用超聲波細胞粉碎機將組織進一步打碎，冰上繼續裂解30 min后，4℃ 16 000g離心15 min，收集上清，利用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。

5.Western Blot檢測：蛋白變性后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離蛋白，然后將其轉印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。電轉結束后用5%脫脂奶粉封閉1 h，所有一抗均按照1∶1 000稀釋后4℃孵育過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)漂洗;所有二抗均按照1∶2 000稀釋后室溫孵育1 h，PBST漂洗，化學發光法(ECL)顯影。利用Image J軟件分析目標條帶的灰度值。β-actin為內參，每組實驗至少重復3次。

四、統計學分析

結 果

一、PCNB亞急性暴露對大鼠一般情況及卵巢系數的影響

灌胃期間各組大鼠毛發、粘膜和自主活動等一般情況良好，未出現異常或死亡。在PCNB亞急性暴露期間，高、低劑量組大鼠的體重變化、卵巢系數與對照組比較均無顯著差異(P>0.05)(圖1)。

A：體重變化情況；B：卵巢系數圖1 PCNB亞急性暴露后SD大鼠體重及卵巢系數的變化情況

二、PCNB亞急性暴露對SD大鼠血清孕酮和E2水平的影響

電化學發光法檢測發現，高、低劑量組大鼠血清孕酮水平均顯著高于對照組，血清E2水平均顯著低于對照組(P<0.05)(圖2)。

三、PCNB亞急性暴露對大鼠卵巢組織StAR、P450scc和Aromatase表達水平的影響

Western Blot結果顯示，大鼠卵巢組織中StAR的表達量低劑量組>高劑量組>對照組，各組組間差異均無統計學意義(P>0.05)；大鼠卵巢組織中P450scc表達量高劑量組>對照組>低劑量組，各組組間差異均無統計學意義(P>0.05)；低、高劑量組大鼠卵巢組織中Aromatase表達水平均顯著低于對照組(P<0.05)，并呈劑量依賴性下降(圖3)。

A：孕酮；B：E2。與對照組比較，*P<0.05圖2 亞急性暴露PCNB后SD大鼠血清孕酮及E2水平的變化

A：Western Blot檢測；B：灰度分析柱狀圖。與對照組比較，*P<0.05圖3 PCNB亞急性暴露后SD大鼠卵巢組織中StAR、P450scc和Aromatase表達情況

討 論

多項研究表明，卵巢是多種環境污染物的重要靶器官，環境因素是導致卵巢功能異常的重要原因之一[14]。作為一種常見的環境污染物，PCNB對卵巢功能影響的研究目前鮮少報道。本研究在實驗室前期工作的基礎上進一步探究了PCNB亞急性暴露對SD大鼠卵巢功能的影響。我們對不同劑量PCNB暴露后大鼠血清孕酮和E2水平進行了檢測，結合卵巢甾體激素合成關鍵酶的表達變化情況，初步探索了PCNB亞急性暴露對卵巢功能的影響及可能機制。

本研究發現，PCNB亞急性暴露期間大鼠的一般情況良好，各實驗組SD大鼠體重與對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)，提示PCNB亞急性暴露對SD大鼠無顯著系統毒性，這與Khera等[15]的研究結果一致。PCNB連續暴露28 d后各實驗組大鼠血清孕酮水平均顯著高于對照組，血清E2水平均顯著低于對照組(P<0.05)。為探究PCNB亞急性暴露對甾體激素合成關鍵酶的影響，本研究檢測了各實驗組SD大鼠卵巢組織中StAR、P450scc以及芳香化酶的表達情況。Western Blot結果顯示，與對照組比較，各實驗組SD大鼠卵巢組織StAR的表達均上調，其中低劑量組>高劑量組，但各組組間無統計學差異(P>0.05)；與對照組比較，低劑量組大鼠卵巢組織中P450scc表達上調，高劑量組P450scc表達下調，但各組組間均無統計學差異(P>0.05)。甾體激素合成關鍵酶StAR和P450scc的表達量在低劑量組均高于高劑量組，這與大鼠血清孕酮水平的表達情況相一致。Western Blot結果提示，StAR及P450scc可能均在PCNB亞急性暴露導致的血清孕酮水平上調中發揮作用。芳香化酶作為卵巢組織合成E2的限速酶，PCNB暴露后其蛋白表達量顯著下降，這與血清E2水平下降相吻合，提示PCNB亞急性暴露可能通過下調芳香化酶的表達量而影響卵巢組織E2的分泌。本實驗室前期研究了PCNB暴露7 d對大鼠卵巢功能的影響，發現PCNB可顯著下調血清孕酮水平(P<0.05)，并導致血清E2水平下降，但差異無統計學意義(P>0.05)[12]。這與本實驗發現PCNB亞急性暴露引起大鼠血清孕酮升高、血清E2下降的結果不一致，導致這一現象的原因可能與PCNB體內暴露時間不一致有關；另外本次實驗觀測終點時大鼠已進入青春期，體內參與激素調控的機制更為復雜，對甾體激素生成也可能產生影響。實驗室前期研究均發現，PCNB暴露7 d顯著上調大鼠卵巢中StAR的表達[12]，本研究也檢測到PCNB亞急性暴露上調大鼠卵巢StAR的表達水平，提示StAR在PCNB暴露導致的卵巢甾體激素分泌紊亂中發揮了不可忽視的作用。本課題組前期研究發現，PCNB暴露7 d可導致卵巢生長卵泡比例顯著升高，卵巢組織最大切面截面積增大[12]；本次實驗觀察到PCNB暴露后導致SD大鼠卵巢系數增加，但差異無統計學意義(P>0.05)，提示PCNB亞急性暴露可能對大鼠卵巢發育產生一定影響。

PCNB進入哺乳動物體內后，可產生包括五氯苯酚、五氯硫酚、五氯硫島代苯甲醚在內的多種代謝物質[16]，其中的某些代謝產物如五氯苯酚可導致黃體功能不全、卵泡發育異常等不良后果，損傷卵巢正常功能[17-18]，提示PCNB可通過其在體內的代謝產物對卵巢功能產生不良影響。另外由于生產工藝等的限制，PCNB中會含有微量六氯苯、二噁英等雜質[19-20]，這些雜質可在生物體內蓄積，并影響血清甾體激素水平，干擾大鼠正常發情周期，降低雌性哺乳動物生育力等[21-22]。目前尚不能排除PCNB含有的微量雜質對卵巢功能的影響。此外肝臟作為代謝PCNB的主要臟器，PCNB暴露可造成肝臟損傷[23]，同時肝臟作為多種甾體激素轉化、降解的重要器官，它是否參與了亞急性暴露PCNB對甾體激素的影響有待進一步的研究。

綜上，本研究發現PCNB亞急性暴露后，可造成大鼠血清孕酮和E2表達水平的變化，并上調大鼠卵巢組織StAR蛋白表達，同時下調芳香化酶蛋白表達，這提示PCNB亞急性暴露可能通過影響甾體激素合成關鍵酶的表達來影響雌孕激素的分泌，干擾卵巢正常功能，這為探究PCNB對生殖功能的毒性研究提供了新的參考。