低氧和低氧誘導因子在月經樣小鼠模型中對子宮內膜崩解的作用

梁敏，陳西華，王樹芳，張欣，魯聰，武斌，南楠，張博男，賀斌，徐祥波*

(1.國家衛生健康委科學技術研究所，北京 100081；2.北京協和醫學院研究生院，北京 100730；3.新鄉醫學院，新鄉 453003；4.山東大學附屬濟南市中心醫院，濟南 250013)

月經對女性生殖健康具有重要意義。月經是指女性子宮在雌激素和孕激素的作用下，周期性發生內膜增厚、血管和腺體增生、崩解出血以及修復的生理過程。子宮低氧狀態可以通過子宮內膜血流減少、血氧分壓降低，或檢測到低氧標志物——派諾硝唑等判定[1-3]。目前，對于月經期間子宮組織是否存在低氧狀態一直存有爭議。Markee[4]構建了經典的月經模型，他們將人類子宮內膜移植到恒河猴眼內并發現，在月經開始(即血液釋放)之前，可以在4～24 h觀察到螺旋小動脈血管收縮，24 h后螺旋小動脈血管發生劇烈收縮導致子宮內膜組織處于低氧狀態并造成子宮內膜組織壞死。此外，我們的既往研究發現，與低氧相關的關鍵因素——低氧誘導因子1A(Hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF1A)在月經樣小鼠子宮內膜崩解時表達升高并激活下游基因[5]。在人類子宮內膜中，HIF1A在月經期的子宮內膜細胞核中表達量最高[1，6]。Maybin等[7]最近的研究發現，月經期間月經大出血女性的的子宮內膜中HIF1A表達量低于正常女性。在小鼠月經樣模型中，高氧(75% O2)、HIF1A抑制劑或基因誘導引起的HIF1A降低均能延緩子宮內膜修復，而正常水平的HIF1A則促進子宮內膜修復過程，這項工作證實低氧和HIF1A在正常子宮內膜修復中的重要性[8]。有研究發現，小鼠生理性月經模型P4撤退后2 d子宮組織派諾硝唑染色呈陽性[3]，并在P4撤退后8 h和24 h時發現，蛻膜化細胞與子宮內膜分界處可見強烈低氧狀態[9]，以上結果揭示了小鼠子宮內膜存在生理性低氧狀態。然而，也有研究認為月經期間子宮組織不存在低氧狀態。有研究通過監測人子宮內膜溫度和氙-133 清除率發現，子宮內膜的血流在月經前或月經期間均未減少[1]。Gannon等[2]利用電子順磁共振血氧測定技術和組織氧分壓檢測系統觀察發現，移植的人子宮內膜由于停止給予孕酮(P4)激素(又稱P4撤退)而崩解，但沒有檢測到顯著的氧分壓改變，只在少數移植的子宮內膜中檢測到派諾硝唑。

小鼠月經模型建立于1984年[10]，2003年小鼠月經樣模型又有了進一步的優化[9]。2007年Xu等[11]成功建立了基于P4藥理撤退的小鼠月經樣模型。Finn等[10]切除小鼠卵巢后，通過周期性皮下注射E2和P4，隨后向宮腔內注射花生油來誘導子宮內膜蛻膜化，在P4撤退后小鼠的子宮內膜出現了類似高等靈長類雌性的經期崩解出血現象。小鼠月經樣模型可以實時研究子宮內膜崩解，并允許體內干擾的存在。因此，本研究將利用小鼠月經樣模型進一步探索低氧和HIF1A在子宮內膜崩解中的作用。

材料和方法

一、實驗動物

8～10周齡的SPF Ⅱ級C57BL雌性小鼠49只，購自中國醫學科學院實驗動物研究所，實驗動物許可證：SCXK(京)2019-0014。飼養條件：給予充足的水和食物飼養，保持明暗交替各12 h，溫度(21±1)℃，濕度50%～60%。所有動物實驗及手術操作均獲國家衛生健康委科學技術研究所動物倫理委員會審查批準。

二、實驗試劑及儀器

E2(Alfa Aesar，美國)，P4(Sigma-Aldrich，美國)，二氯化鈷(CoCl2)(UN3077，上海國藥)，低氧探針試劑盒(HP3-100，Burlington，美國)，兔抗HIF1A單抗(NB100-134，Novus，美國)，蘇木素伊紅染液、山羊抗兔增強二步法檢測試劑盒(PV6100，北京中杉金橋)，核蛋白提取試劑盒(Thermo，美國)，β-Actin一抗(北京科溫生物)，Lamin-B 一抗(SC-20682，Santa，美國)，增強化學發光(ECL)試劑盒(北京全式金生物)；凝膠成像系統(Minichemo 500TM，北京賽智)，光學顯微鏡(XS-23C，上海蒲柘光電)。

三、研究方法

1.小鼠月經樣模型的建立：根據以往的研究建立小鼠生理性P4撤退月經樣模型[9-11]。對小鼠行雙側卵巢切除術，休養2周后記為第1天，第1～3天9：30在小鼠背部皮下注射100 ng E2；第4～6天，小鼠不做處理，正常飼養；第7天9：30在小鼠背部皮下注射50 ng P4和 5 ng E2后在小鼠背部皮下植入含有P4的硅膠管(P4維持)[12]；第8～9天9：30在小鼠背部皮下注射5 ng E2；第9天11：30打開小鼠背部，經雙側子宮角向宮腔內注射15 μl無菌花生油以誘導子宮蛻膜化；在子宮蛻膜化49 h后，移除P4硅膠管(P4撤退，記為取材0 h)。分別在0 h、8 h、12 h、16 h、24 h時處死小鼠并收集子宮，雙側子宮組織用4%多聚甲醛固定或于-80℃冰凍儲存待用。

3.低氧探針檢測：小鼠處死前30 min經腹腔給予低氧探針 60 mg·kg-1，并根據說明書對低氧探針進行免疫組化分析。隨機選擇P4撤退后不同時間點各組小鼠各3只的3張不同切片，隨機拍攝5個視野(非重疊視野，不含肌層)，采用圖像處理程序Image J(https：//imagej.nih.gov/ij/)，計算各顯微圖像中 3，3-二氨基聯苯胺(DAB)的染色面積比例。

4.免疫組化檢測HIF1A蛋白：取出固定好的子宮組織切片脫蠟、復水，在95℃、pH 6.0的枸櫞酸緩沖液中浸泡20 min以修復抗原，切片在3%的H2O2中浸泡15 min，核蛋白HIF1A單抗以1∶500稀釋并在4℃下孵育過夜，洗滌之后用山羊抗兔增強二步法檢測試劑盒室溫孵育1 h，然后用DAB室溫孵育1 min。每張切片隨機拍攝5個視野(無重疊視野，無肌層)，分別對每個視野的細胞數和HIF1A核染色的細胞進行計數。

5.Western Blot檢測：用核蛋白提取試劑盒分別提取小鼠子宮冰凍樣本的細胞核蛋白與細胞質蛋白，并加入適量蛋白酶抑制劑。單組蛋白的總量為15 μg，在4%～12% SDS-PAGE內進行凝膠電泳；轉膜后，在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h；隨后用HIF1A單抗以1∶500稀釋，β-Actin、Lamin-B 抗體分別以1∶2 000稀釋為細胞質、細胞核內參，室溫孵育3 h；用HRP標記的小鼠抗兔IgG抗體以 1∶10 000稀釋與之雜交；然后用增強化學發光(ECL)試劑盒檢測。

6.石蠟組織切片 HE染色：小鼠子宮組織在4%多聚甲醛固定72 h，制作常規石蠟切片。脫蠟后經梯度乙醇溶液水化，分別于蘇木精染料室溫染色1 min、1%鹽酸乙醇溶液分化1 s、1%氨水乙醇溶液返藍20 s、1%伊紅染液復染2 min(每步染色操作后均用清水沖洗3次)。梯度脫水后用中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并拍照。

四、統計學分析

應用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計量資料以平均數±標準差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗，不符合正態分布的數據分析采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、月經樣小鼠子宮崩解過程中低氧與HIF1A的相關性

月經樣小鼠P4撤退0 h 時，低氧探針定位于小鼠子宮腔上皮細胞、上皮下蛻膜基質細胞著床側的一小片區域，HIF1A主要位于大部分蛻膜區域的胞質內，但在上皮下蛻膜基質細胞細胞核中也有HIF1A表達；月經樣小鼠P4撤退8 h 時，低氧探針出現在整個蛻膜區，并不局限于上皮下區域，HIF1A在蛻膜基質細胞胞漿中表達增多，在細胞核中也有表達，尤其在管腔上皮細胞和蛻膜基質細胞中表達最多；月經樣小鼠P4撤退12 h 時，低氧探針集中在完好的蛻膜組織與著床側、壞死區外緣的交界處，蛻膜組織中HIF1A的表達位置與低氧探針一致；月經樣小鼠P4撤退16 h 時，低氧探針集中在壞死區外緣，此時HIF1A的定位與低氧區相似，定位于多個細胞核；月經樣小鼠P4撤退24 h時，低氧探針染色減少，僅在破裂區邊緣和上皮細胞可見，在低氧區交界處的可見少量核染色細胞。免疫組化半定量結果顯示，月經樣小鼠P4撤退后12 h和16 h時小鼠子宮組織低氧探針染色面積百分比和HIFA的表達水平均顯著高于 P4撤退0 h時(P<0.05)(圖1、2)。

A：P4撤退后不同時間點低氧探針染色結果(免疫組化染色 ×100)；B：P4撤退后不同時間點低氧探針染色面積百分比。與0 h比較，**P<0.01圖1 P4撤退后不同時間點月經樣小鼠子宮組織的低氧探針染色情況

A：P4撤退后不同時間點HIF1A染色情況(第一行圖片為免疫組化染色 ×100，第二行圖片免疫組化染色 ×400)，箭頭為HIF1A核染色細胞；B：P4撤退后不同時間點HIF1A核染色細胞百分比。與0 h比較，*P<0.05圖2 P4撤退后不同時間點月經樣小鼠子宮組織HIF1A的表達情況

二、月經小鼠崩解過程與低氧的關系

三、各組小鼠子宮組織細胞質和細胞核中HIF1A的表達情況

A：子宮大體形態結果；B：小鼠子宮形態(HE染色 ×100)C：小鼠子宮形態(HE染色 ×400)圖3 P4撤退后24 h各月經樣小鼠組的子宮大體和子宮組織形態結果

A：小鼠子宮組織低氧探針免疫組化染色；B：低氧探針染色面積百分比；C：小鼠子宮組織HIF1A免疫組化染色；D：HIF1A核染色細胞百分比。與組比較，*P<0.05圖4 月經樣小鼠注射CoCl2模擬低氧的效果

A：Western Blot檢測細胞質中HIF1A的表達；B：Western Blot檢測細胞核中HIF1A的表達；C：細胞質中HIF1A表達灰度分析；D：細胞核中HIF1A表達灰度分析。與組比較，*P<0.05圖5 各組月經樣小鼠子宮組織細胞質和細胞核HIF1A的表達情況

討 論

本研究以小鼠月經樣模型為基礎，不僅證實了小鼠子宮在子宮內膜崩解中存在低氧狀態，并進一步闡明了P4撤退、低氧和HIF1A在小鼠子宮內膜崩解中的作用。結果顯示，P4撤退后子宮組織低氧區域從腔上皮細胞逐漸擴展到整個蛻膜區，并在P4撤退后12 h和16 h時低氧強度增加，提示低氧與子宮內膜崩解有關。另外，HIF1A在細胞核內的表達位置與低氧區域一致，特別是在P4撤退后12 h時，HIF1A的免疫組化染色區域與低氧探針染色區域高度重合。P4撤退后不同時間點的低氧變化情況，以及HIF1A核染色細胞百分比和分布情況與低氧的相關性，提示在子宮內膜崩解時低氧激活了HIF1A蛋白。

既往月經樣模型相關研究顯示，月經樣小鼠子宮內膜在P4撤退后8 h內保持完整，24 h內子宮內膜達到完全崩解[12，14-15]。在P4撤退后12 h時回補P4可以抑制子宮內膜崩解，由此推斷P4撤退后12 h為P4撤退的關鍵時期[16-17]。根據之前的研究，我們判定月經樣小鼠子宮內膜崩解的時期為0～24 h[14-17]。有研究發現，在P4撤退后0 h、4 h、8 h和24 h可以觀察到月經樣小鼠子宮存在低氧狀態[5，18]。Maybin等[6-7]支持月經期間子宮存在低氧的論斷，并認為HIF1A可能是一種有效的、非激素性治療月經大量出血的方法，提示HIF1A在月經異常出血中的重要性。

本研究以小鼠月經樣模型為基礎，通過更精細的時間進程(包括P4撤退后12 h和16 h)，揭示了蛻膜化的子宮內膜存在低氧狀態，低氧區域和P4撤退后激活的HIF1A定位有很強的相關性。在月經樣小鼠模型中使用CoCl2模擬低氧狀態結果顯示，子宮內膜崩解是由P4撤退引起的，而不是由CoCl2模擬低氧引起的，即低氧參與子宮內膜崩解但不是必要因素。