纖維素降解菌的篩選與誘變育種

馮偉 馮雅琪 徐晶雪

摘 要：纖維素占植物體干重的35%～50%，由于纖維素水解、利用較困難，若處理不當(dāng)會(huì)造成環(huán)境污染。該研究以常年堆放秸稈的腐殖土壤和果樹下土壤為試驗(yàn)材料，采用剛果紅纖維素瓊脂平板初篩、羧甲基纖維素（CMC）平板復(fù)篩，篩選出12株具有降解纖維素功能的菌株，其中4株具有較明顯的透明圈，且羧甲基纖維素酶活力（CMC）和濾紙酶活力（FPA）較高。采用紫外線誘變育種得到3株CMC酶提高較多的突變株，其中突變株的CMC酶活較原始菌株提高最達(dá)到57.4%。

關(guān)鍵詞：纖維素;纖維素酶;紫外線;誘變育種

中圖分類號(hào) X172文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）09-0041-03

Abstract： Cellulose accounts for 35%-50% of the dry weight of plant body. It is difficult to hydrolysis and utilize cellulose， and improper treatment of cellulose causes environmental pollution. Based on perennial piled straw soil under the humus soil and fruit trees of as experiment material， adopting Congo red cellulose AGAR plate screen at the beginning of carboxymethyl cellulose （CMC） tablet after screen got 12 strains screened out which has the function of cellulose degradation strains， including four strains has a clear， transparent circle and carboxymethyl cellulose （CMC） enzyme and enzyme filter paper （FPA） is higher. The CMC activity of three mutant strains was 57.4% higher than that of the original strain.

Key words： Cellulose; Cellulase; Ultraviolet （uv）; Mutation breeding

資源與環(huán)境問(wèn)題是21世紀(jì)人類面臨的最主要挑戰(zhàn)，利用可再生資源代替不可再生資源是應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)的唯一途徑。纖維素是自然界中最豐富的天然可再生碳水化合物，其占植物體干重的35%～50%，是地球上分布最廣、含量最多的有機(jī)物。但是，由于纖維素水解、利用都很困難，致使其利用具有一定的局限性[1]。因此，尋找具有高效纖維素酶的微生物是關(guān)鍵。

本研究通過(guò)對(duì)腐殖土壤中的纖維素降解菌進(jìn)行篩選，篩選出具有降解纖維素作用的纖維素分解菌，并對(duì)其降解纖維素能力進(jìn)行測(cè)定，最終分離出自然生長(zhǎng)且具有高效降解纖維素作用的菌種，為利用微生物降解纖維素技術(shù)開發(fā)和利用纖維素資源提供候選菌株。

1 研究方法

1.1 培養(yǎng)基配制

1.1.1 選擇培養(yǎng)基 KH2PO4 2g，（NH4）2SO4 1.4g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl2 0.3g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5mg，MnSO4 1.6g，ZnCl2 1.7g，CoCl2 1.7g，1%纖維素，pH 7.0，蒸餾水定容1000mL。

1.1.2 剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基 MgSO4 0.25g，KH2PO4 0.5g，瓊脂20g，明膠2.0g，羧甲基纖維素鈉1.88g（纖維素粉預(yù)先經(jīng)1mmol/L鹽酸冷處理12h，以水清洗無(wú)鹽酸后用來(lái)配制培養(yǎng)基），剛果紅0.2g，蒸餾水1000mL，pH7.0[2]。

1.1.3 CMC培養(yǎng)基 （NH4）2SO4 2g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.05g，NaCl 1g，羧甲基纖維素鈉15～20g，蒸餾水1000mL，pH6.0，固體培養(yǎng)基加瓊脂20g瓊脂。

1.1.4 發(fā)酵（產(chǎn)酶）培養(yǎng)基 （NH4）3PO4 0.2g，MnSO4·7H2O 1.0mg，KH2PO4 0.8g，CaCl2 20mg，MgSO4·7H2O 0.9g，酵母膏1.0g，檸檬酸鐵5mg，蛋白胨2g，維生素100μg，蒸餾水1000mL，pH自然。100mL發(fā)酵培養(yǎng)基，加入纖維素粉3g。

1.2 纖維素降解菌篩選

1.2.1 纖維素降解菌的初篩 稱取土樣10g加入50mL選擇培養(yǎng)基中，30℃下?lián)u床培養(yǎng)1d。將菌懸液采用稀釋涂布法選擇適宜稀釋度接種于剛果紅纖維素培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)3d后觀察是否產(chǎn)生透明圈。

1.2.2 纖維素降解菌的復(fù)篩 挑取初篩得到的菌株三區(qū)劃線接種到CMC培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3d后挑取培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的單菌落再次接種到CMC培養(yǎng)基上，在30℃條件下培養(yǎng)3d后，先用1mg/mL的剛果紅染色3min，再用濃度為0.9%NaCL進(jìn)行沖洗，最后觀察測(cè)定透明圈直徑大小。將得到的具有透明圈菌株進(jìn)行革蘭氏染色[3]。

1.3 菌株纖維素酶活力測(cè)定

1.3.1 粗酶液制取 吸取1mL菌懸液加入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃發(fā)酵4d，用5層紗布對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行過(guò)濾，在4000r/min條件下離心15min，采集上清液即為粗酶液[4]。

1.3.2 羧甲基纖維素酶活力（CMC）測(cè)定 采用DNS法測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。菌株酶力測(cè)定在試管中加入1.5mL 0.5% CMC-Na的檸檬酸緩沖液，然后再取0.5mL粗酶液加入其中，輕輕搖晃混合均勻，在50℃水浴鍋中作用30min后取出立即按DNS法測(cè)定糖。

1.3.3 濾紙酶活力（FPA）的測(cè)定 在試管中加入1.5mL醋酸-醋酸鈉緩沖液，再加入0.5mL酶液，緩慢搖動(dòng)，混合均勻。將去淀粉濾紙（1cm×6cm）放入試管中，使溶液淹沒(méi)濾紙，50℃水浴鍋保溫1h后，按DNS法測(cè)定糖[5]。

式中：180.16：葡萄糖分子量;0.5：酶原液的體積（mL）;30：反應(yīng)時(shí)間（min）;n：酶液稀釋倍數(shù)。

1.4 紫外誘變育種 在帶有轉(zhuǎn)子的培養(yǎng)皿中加入6mL菌懸液，用紫外燈（15W，30cm）分別照射1、2、3、4、5、6、7、8min后，分別吸取0.2mL稀釋液涂布于纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行。30℃下避光培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率，并繪制致死曲線以選擇最佳誘變劑量，測(cè)定誘變后突變菌株酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 初步篩選的纖維素降解菌 將采集的土壤樣品制備成懸液涂布于剛果紅纖維瓊脂培養(yǎng)基中，得到12株產(chǎn)透明圈菌株，其中4株透明圈較明顯，分別記為L(zhǎng)1、L2、L3、L4，觀察4株菌的菌落形態(tài)并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果見(jiàn)表1。革蘭氏染色結(jié)果顯示4株均為革蘭氏陽(yáng)性菌。純化培養(yǎng)過(guò)程中，菌株L4生長(zhǎng)最快，L2、L3次之，L1生長(zhǎng)最慢。

2.2 復(fù)篩出的菌株 挑取L1、L2、L3、L4這4株候選菌株重新接種，剛果紅透明圈法測(cè)定4株菌株透明圈大小，結(jié)果表2所示。由表2可知，4種菌株均能夠分解纖維素類物質(zhì)，但透明圈直徑大小差距不大。

2.3 菌株的酶活力

2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 利用DNS法，在波長(zhǎng)550nm條件下，線性關(guān)系方程為y=0.177x-0.128，相關(guān)系數(shù)R2=0.994（見(jiàn)圖1）。

2.3.2 菌株的酶活力 4種菌株分別接種到發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，酶活測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，得到3株FPA值超過(guò)0.1U/mL的菌株，且CMC值也較高。

2.4 誘變育種

2.4.1 誘變時(shí)間 將紫外誘變的致死率見(jiàn)圖2，3株產(chǎn)酶量較高的菌株當(dāng)紫外線照射時(shí)間為2min時(shí)，各菌株致死率分在70%～80%，所以將紫外線照射時(shí)間定為2min。

2.4.2 突變菌株 取發(fā)酵培養(yǎng)3d后的突變菌株的培養(yǎng)液，對(duì)其CMC酶活力進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算CMC酶活增長(zhǎng)率。由表4可知，以HC值提高25%以上為篩選指標(biāo)，紫外誘變共篩選到3株目標(biāo)突變菌株L2-1、L3-1、L4-1分別對(duì)應(yīng)原始菌株L2、L3、L4。

3 結(jié)論

本研究采取常年堆放秸稈的腐殖層土壤和果樹下腐殖層土壤作為試驗(yàn)材料，利用選擇培養(yǎng)基和剛果紅纖維素培養(yǎng)基分離純化其中纖維素降解菌，利用DNS法測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行菌株培養(yǎng)，培養(yǎng)3d后測(cè)定菌株酶活力，得到4株菌CMC酶活力較高菌株，酶活最高可達(dá)0.208 U/mL，F(xiàn)PA酶活最高可達(dá)0.152U/mL;經(jīng)紫外誘變，其中3株突變株的CMC酶活力有較明顯的提高，酶活力的最高提高率達(dá)57.4%。篩選得到高效降解纖維素菌株可以為纖維素的處理與加工及飼料生產(chǎn)等提供備選菌株。

參考文獻(xiàn)

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（責(zé)編：張宏民）