不同氧濃度下甲烷氧化耦合反硝化及微生物協作機制研究

賴生平，楊洪偉，徐志磊，聶明建，*

(1.重慶德潤環境有限公司，重慶 400000；2.中國市政工程中南設計研究總院有限公司，湖北 武漢 430000)

0 引言

隨著城市化和經濟水平的不斷提升，城市人口數量快速增長，隨之而來的城市生活垃圾的污染問題日益嚴重，如何妥善處置城市生活垃圾是世界各國面臨的難題。我國城市生活垃圾的主要處置方法有焚燒、堆肥和衛生填埋。衛生填埋是20年前垃圾處置的最主要方法，但由于其選址十分嚴苛，并且對地下水、土壤、大氣等均具有較大的污染，給生態系統帶來了極大的威脅(王傳英等[1])。為使填埋技術成為減少垃圾污染的一種技術方案，可采用準好氧填埋技術來改造老式厭氧填埋場或新建準好氧填埋場，更好地抑制垃圾填埋場中液體和氣體污染物的產生。“準好氧填埋”的概念最初是由日本學者Hanashima教授提出的(Lee等[2])，近年來在中國得到廣泛推廣(Wu等[3])。這項技術從填埋場的結構設計出發，通過改造填埋場使內部存在好氧、微氧、厭氧并存的環境，促使垃圾能在不同條件下實現不同途徑的污染物降解。準好氧填埋場中，空氣可以通過滲濾液導排管擴散入填埋場中，使填埋場從上自下形成好氧-微氧-厭氧-好氧的分布。填埋場中厭氧層是形成甲烷和氨氮的最主要場所，而甲烷在向上擴散的過程中，在經過微氧和好氧層時，好氧甲烷氧化菌會利用其代謝特性來氧化甲烷，是垃圾填埋場中最重要的甲烷減排生物活動。氨氮在向下滲流的過程中，經過準好氧填埋場的底層好氧層，易被硝化細菌氧化為硝酸鹽，滲濾液中的有機物也會部分被好氧降解。然而，滲濾液中的有機質和氮源尚未徹底去除，因此，通過滲濾液回灌的形式，將填埋場視作大型生物反應器而進一步去除污染物。回灌滲濾液中的氨氮進一步在表層好氧層中被氨氧化，和填埋場中擴散的甲烷將有可能在缺氧和微氧層相遇，實現甲烷氧化和反硝化的耦合。

不同類型的甲烷氧化耦合反硝化作用可能在不同的氧氣條件下發生：(1)在含氧量約為5%的微好氧層中(Huang等[4])，好氧的甲烷氧化菌通過有氧呼吸氧化甲烷并產生中間有機物，進一步作為反硝化菌的電子供體來實現反硝化，這個過程稱為微好氧甲烷氧化耦合反硝化(MAME-D)；(2)在微好氧和缺氧層界面(IMAN)，有限的氧氣通過甲烷發酵或以硝酸鹽為直接電子受體，執行缺氧甲烷氧化耦合反硝化(HYME-D)。

因此，本研究在實驗室模擬了準好氧填埋場中的微好氧和缺氧環境，探究了甲烷氧化與反硝化是否耦合發生，并分析了參與這些過程的主要微生物。

1 材料和方法

1.1 垃圾樣品

本研究使用的垃圾樣品采集自中國重慶長生橋垃圾填埋場，在5個不同的地點隨機采集兩個深度的樣品，深度約為70 cm和120 cm。來自同一深度的樣本被混合在塑料密封袋中，立即運回實驗室。在整個實驗過程中，對不同深度的樣品分別進行處理。

1.2 培養基和實驗用氣

本實驗使用的培養基為硝酸鹽無機鹽培養基(NMS)，其組成為：KH2PO4200 mg/L、K2HPO4400 mg/L、CaCl2·2H2O 500 mg/L、MgSO4·7H2O 1 000 mg/L、FeSO4·7H2O 9.1 mg/L、NaNO3濃度在200～400 mg/L之間(Huang等[4])。

進口氣體大約由70%的甲烷和0～30%的二氧化碳組成。微好氧反應器添加5%的氧氣，缺氧反應器添加1%的氧氣，對照組反應器不加入氧氣(Huang等[4])，剩下的氣體比例用氬氣填充。

1.3 浸出床生物反應器(LBB)的設置和運行

用于序批實驗的三個等尺寸反應器主要由直徑13 cm的柱子、上流式氣體分配系統和下流式液體滲濾系統構成，反應原理見圖1。從取樣深度70 cm的樣品中取出4 kg的樣品接種到LBB2中，富集MAME-D相關微生物。從取樣深度120 cm的樣品中取出4 kg的樣品接種到LBB3中，富集HYME-D相關微生物。對照試驗中，將70 cm深度的2 kg樣品和120 cm深度2 kg樣品混合后加入LBB1中。將接種物在浸出床生物反應器中馴化培養60 d，使可溶性有機物消耗盡。在此之后，用氬氣吹脫浸出床生物反應器中的空氣，并通入設置比例的甲烷/二氧化碳/氧氣，正式進行序批實驗，實驗運行參數設置詳見表1。根據200～400 mg/L的進水硝酸鹽負荷設置三個實驗階段，總共運行近50 d，每天6個循環，每個循環包括2 min的同時進水和曝氣，56 min的滲濾和2 min的出水。培養基進水為2 L/d。溫度控制在30±1 ℃。壓力保持在大氣壓力。每天收集一次氣體和液體樣本。

圖1 生物反應器設計圖Fig.1 Design drawing of bioreactors

表1 實驗各階段運行參數設置

1.4 分析方法

1.5 DNA提取、PCR擴增以及高通量測序

從序批實驗開始到結束，分別取三個反應器各階段樣本各一個進行DNA分離。使用TOYOBO KOD-Plus-Neo DNA聚合酶和細菌通用引物515F(5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')進行PCR擴增細菌16S rRNA基因。最后，用羅寧生物有限公司高通量測序儀對文庫進行配對測序(2×250 bp)。

2 結果與討論

2.1 甲烷氧化與反硝化耦合的證據

三階段運行期間三套反應器中硝酸鹽和甲烷濃度變化如圖2所示。總體來說，在LBB2和LBB3中成功地實現了甲烷氧化耦合硝酸鹽反硝化。在LBB2中，觀察到大量的甲烷消耗，并且硝酸鹽的消耗程度與甲烷消耗程度保持一致。每階段運行的反硝化率均達到100%，并且第三階段運行的反硝化效率達到最大，其效率為16.54 mmol/d。運行過程中檢測到少量亞硝酸鹽，范圍為0.01～0.98 mmol，在每階段的初期少量累積，后期下降。在MAME-D系統中，最大反硝化效率為16.54 mmol/d，相當于4.82 mg N/(L·d)，高于許多報導的MAME-D體系中的反硝化率(Houbron等[6]，Thalasso等[7]，Waki等[8]，Werner和Kayser[5])。然而，本系統的反硝化率低于Werner和Kayser[5]報導的流化床生物反應器的反硝化率。在LBB3中也觀察到甲烷和硝酸鹽的消耗，最大反硝化率和反硝化效率分別為85.67%和9.88 mmol/d。亞硝酸鹽的積累在第二階段開始時最高(約為0.42 mmol)，然后慢慢下降到0。在不含甲烷的對照試驗組LBB1中，由于接種劑中的有機殘渣和硝酸鹽的同化作用導致硝酸鹽濃度有少量的下降。

圖2 三階段運行期間LBB1、LBB2和LBB3中硝酸鹽和甲烷的濃度變化Fig.2 Concentration changes of nitrate and methane in LBB1,LBB2 and LBB3 during three operation phases

與對照組LBB1相比，微氧和缺氧反應器均表現出較高的甲烷氧化和反硝化活性。此外，MAME-D比HYME-D具有更高的甲烷氧化和反硝化活性。這可能是由于氧氣比硝酸鹽具有更低的氧化電位，使其能夠更快更容易地實現電子傳輸。

2.2 CO2對pH的影響

在實驗中還觀察到了反硝化作用引起的pH升高和CO2調節pH的緩沖作用，結果如圖3所示。在LBB2的第二階段運行中，當混合氣體中的CO2濃度在600 mmol/L以下時，由于反硝化作用pH迅速上升到8。第二階段運行到21天時，pH開始下降(從7.97到7.77)，應該是由于硝酸鹽的消耗殆盡導致反硝化停止。在LBB3的第二階段運行中，由于反硝化作用持續到第二階段運行結束，pH從7.38一直增加到7.88。可見，反硝化作用與pH值變化呈明顯的負相關性。據報道，MAME-D和HYME-D的最佳pH值為7～8(He等[15]，Sun等[16])。因此，持續的反硝化作用可能導致pH超出最佳反應pH范圍。CO2是垃圾填埋場厭氧發酵的天然產物，占準好氧垃圾填埋場沼氣成分的19%～28%(Huang等[5])。因此，二氧化碳可以是一個重要的反硝化pH緩沖物。從第三階段運行可以看出，當CO2的濃度從250 mmol/L提高到1 297.31 mmol/L(LBB2)和從590 mmol/L提高到1 552.69 mmol/L(LBB3)時，pH出現明顯下降，在LBB2中從7.77下降到7.21，在LBB3中從7.88下降到6.91。在第三階段運行中，雖然LBB2和LBB3的pH值仍有明顯的上升，但在后期穩定在7.6和7.4的水平，說明CO2有很好的緩沖作用。

圖3 LBB2和LBB3中第二和第三階段的pH、硝酸鹽濃度和二氧化碳濃度變化Fig.3 Changes of pH,nitrate and CO2 concentrations in LBB2 and LBB3 during the second and third stages

2.3 MAME-D和HYME-D的群落多樣性和功能微生物

從LBB1、LBB2和LBB3的富集培養物中提取全基因組DNA，構建16S rRNA基因克隆文庫。圖4系統發育樹顯示了豐度較高的前28個菌株。由圖4可知，大多數菌株種類屬于變形桿菌門。γ-變形桿菌門中的甲基雙球菌科(Methylococcaceae)和β-變形桿菌門中的Methylophilaceae在科水平上分別在LBB2和LBB3中占優勢。此外，Methylophilaceae中的甲基菌屬(Methylobacillus)在LBB2和LBB3的末期分別占有1 646和11 051個OTUs，相對豐度分別為6.3%和10.05%。甲基桿菌屬(Methylobacter)屬于甲基雙球菌科(Methylococcaceae)，OTUs分別為1 172和8 475，在LBB2和LBB3中分別占末期相對豐度的4.11%和7.55%。甲基單胞菌(Methylomonas)在甲基雙球菌科(Methylococcaceae)中，共有1 250和8 747個OTUs，最終分別占LBB2和LBB3中相對豐度的4.78%和8.0%。這三種細菌在兩種體系中均顯著富集，在LBB3中更為豐富。

圖4 富集培養樣品的系統發育關系Fig.4 Phylogenetic relationships of enrichment culture samples

Wei等[17]報道甲基桿菌屬是低氧(O25%～20%)環境中最重要的甲烷氧化菌之一。甲基單胞菌還具有將甲烷好氧氧化或缺氧氧化成有機化合物的重要潛力(Ogiso等[18])。甲烷氧化產生的主要有機中間體有甲醇、乙酸鹽(Costa等[19])、檸檬酸鹽和蛋白質(Eisentraeger等[20])。據報道，甲基菌屬可以利用甲基營養物的甲醇基和甲胺基作為碳源來進行硝酸鹽反硝化作用(Doronina等[21])。因此，可以確定甲基桿菌、甲基單胞菌和甲基菌屬的結合可以實現微氧環境下的甲烷氧化耦合反硝化。此外，有多項研究報導，在甲烷和硝酸鹽充足的情況下，甲基單胞菌在好氧和厭氧環境的界面處(IMAN)豐富而活躍，這與在LBB3中觀察到的現象一致。它們在缺氧條件下豐富的原因可能是甲烷發生了發酵，為甲烷氧化菌的生存提供了能量。甲烷發酵產生的中間體比甲烷氧化產生的中間有機物更加豐富(Kalyuzhnaya等[13])。因此，大量的電子供體被運送到甲基營養性反硝化菌(如甲基菌屬)，從而發生反硝化作用。這也可以解釋為什么甲基菌屬在LBB3中的相對豐度高于LBB2。

2.4 準好氧垃圾填埋場碳氮共循環系統假設

研究結果表明，氣體擴散、液體滲濾、反硝化和甲烷氧化之間存在相關性，這在準好氧垃圾填埋場具有很好的適用性，詳見圖5。這些過程還可能與氨氧化、硝化、有機降解和厭氧消化有關。

圖5 準好氧垃圾填埋場氮碳共循環系統假設Fig.5 Hypothesis of nitrogen and carbon co-cycling system in semi-aerobic landfills

由圖5可以看出，在準好氧垃圾填埋場中，空氣被動擴散到滲濾液排水系統，導致COD下降，氨氮被硝化。因此，低COD負荷和高硝酸鹽濃度的再循環滲濾液滲透到上部好氧區。在這一領域，有機殘留物可以進一步降解，但高氧濃度抑制反硝化菌的活性。因此，硝態氮不能在表層土壤中被反硝化。

在中微好氧層中，LBB2中發現的甲基單胞菌和甲基桿菌屬等細菌在5%的氧條件下將甲烷氧化為有機化合物。隨后，本研究鑒定的甲基桿菌將硝酸鹽和有機化合物轉化為CO2、N2和OH-。在IMAN層中，厭氧層中產生的甲烷和殘留的硝酸鹽可以通過甲基單胞菌甲烷發酵和甲基菌屬還原硝酸鹽發生HYME-D。這兩個過程都會產生二氧化碳和OH-，它們同時起緩沖作用，維持系統的中性條件。

3 結論

采用MAME-D和HYME-D系統在浸出床生物反應器中進行了脫氮、甲烷氧化的實驗研究，得出以下結論：

(1)與HYME-D工藝相比，MAME-D工藝具有更高的反硝化效率和甲烷氧化效率；

(2)注入體系的CO2作為良好的緩沖液維持pH的穩定；

(3)細菌群落系統發育分析揭示了甲基桿菌屬和甲基單胞菌分別在微氧和缺氧條件下的甲烷氧化和甲烷發酵功能。同時，甲基菌屬消耗中間有機物并完成反硝化；

(4)基于上述結論，在準好氧垃圾填埋場中提出了一種基于MAME-D和HYME-D的新型氮碳循環系統：在準好氧填埋場微好氧層中，甲烷氧化的有機物供給反硝化菌碳源發生反硝化作用；在缺氧層，甲烷通過甲基單胞菌發生甲烷發酵作用，并和甲基菌屬作用進行反硝化。