HBcAg在肝細胞中的表達及其與抗病毒療效的關系

付喜花，黃 璇，沈國俊，婁海波，毛玉巧

1 廣州市番禺區中心醫院 感染科，廣州 511400； 2 南方醫科大學南方醫院 感染科，廣州 510515；3 九江市第三人民醫院 肝病防治專科，江西 九江 332000

慢性乙型肝炎(CHB)是肝硬化和肝細胞癌(HCC)發生的主要原因[1]。核苷類藥物可以有效抑制HBV復制，但需要長期治療，且停用后復發風險高，因此尋找預測抗病毒療效的指標成為CHB治療的重要臨床問題[2-3]。HBeAg血清學轉換作為HBeAg陽性的CHB患者抗病毒療效反應的重要替代終點之一，在臨床研究中得到廣泛認可[4-5]。

近年來，不斷有研究發現血清抗-HBc定量對于預測CHB患者抗病毒療效具有重要意義，發生HBeAg血清學轉換的患者其治療前血清抗-HBc定量明顯升高[6-7]。另外，核苷類藥物抗病毒停藥時高血清抗-HBc定量與停藥后復發率降低有關[8]。抗-HBc的產生由HBV中的HBcAg刺激機體免疫細胞產生，而HBcAg在肝內分布特點以及其對免疫細胞的刺激作用的相關研究報道仍然相對缺乏。因此，深入探索HBcAg表達與HBeAg血清學轉換之間的關系，將有助于CHB患者臨床療效的預測，對CHB治療新靶點研發具有指導意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2015年1月—2018年6月在南方醫院和番禺區中心醫院采用核苷類藥物行抗病毒治療的101例CHB患者作為研究對象，并對所有患者隨訪96周?；颊咴\斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[1]，且為HBeAg陽性，并排除了合并甲、丙、丁和戊型肝炎，自身免疫性肝病。排除未經抗病毒治療或者使用了干擾素治療方案的患者。

1.2 觀察指標 實驗所用的血清為臨床檢測項目剩余標本。采用美國Beckman全自動生化分析儀檢測患者血清中的生化指標(ALT、AST、TBil)；采用全自動實時熒光定量PCR檢測血清HBV DNA(試劑購自廣州達安基因診斷中心)；采用Abbott i2000化學發光免疫分析儀進行HBV血清標志物中的各項指標的檢測。

1.3 肝臟病理和HBcAg免疫組化染色 所有患者均接受B超引導下的肝穿刺活檢，采用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片制作由病理科醫生負責。5 μm石蠟切片在65 ℃中脫蠟2 h后水化，PBS緩沖液充分洗滌后在枸櫞酸鈉緩沖液中進行高壓抗原修復，3% H2O2浸泡10 min，PBS緩沖液洗滌，10% BSA常溫封閉1 h，加入兔抗人HBcAg抗原抗體[基因科技(上海)股份有限公司，貨號GB058607]，4 ℃孵育16 h，PBS洗滌后加入羊抗兔HRP，DAB進行顯色。HBcAg免疫組化結果通過Image J軟件進行半定量分析，HBcAg表達量在0～5%為 Ⅰ 級，5%～25%為 Ⅱ 級，25%～50%為 Ⅲ 級，大于50%為 Ⅳ 級。

1.4 GEO數據庫分析 通過GEO2R網上在線分析工具(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)分析GSE96851數據集中的差異基因表達。該數據庫中10例肝移植供者肝臟組織和7例血管瘤患者切除肝組織為對照組，急性肝衰竭患者組織4例為實驗組(其中3例標本有4個重復檢測數據，1例標本有5個重復檢測數據，共17個測序數據)。差異基因的篩選標準為|logFC (fold change)|≥2且調整后的P值<0.05。火山圖使用EXCEL作圖。

1.5 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 干燥采血管收集患者2 ml全血，離心后留取血清標本。采用北京萬泰生物藥業股份有限公司的總核心抗體定量和IgM型核心抗體ELISA試劑盒，嚴格按照說明書操作步驟進行操作，對患者血清中的核心抗體進行檢測。使用美國博騰公司酶標儀Gen5，讀取450 nm檢測值，使用分光光度(optical density,OD)值進行比較分析。

1.6 倫理學審查 本研究方案經由廣州市番禺區中心醫院倫理委員會審批，批號：PYRC-2020-020，所納入患者均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 CHB患者基本信息 101例患者在接受96周抗病毒治療后，有17例患者發生HBeAg血清學轉換。HBeAg血清學轉換和未轉換患者在基線時，年齡、AST、TBil、HBV DNA載量和HBsAg定量均無統計學差異(P值均>0.05)，但是發生HBeAg轉換的患者ALT水平較高(P=0.035)(表1)。

2.2 CHB患者肝內HBcAg的表達類型和方式 通過對101例患者肝穿活檢石蠟標本進行HBcAg免疫組化染色，結果發現CHB患者肝內HBcAg表達主要分成4個類型，分別為無表達型、核型表達(HBcAg表達于肝細胞核)、漿型表達(HBcAg表達于肝細胞胞漿)和核漿表達(HBcAg同時表達于肝細胞核和胞漿)(圖1)。

2.3 HBcAg表達類型、病理分級與HBeAg血清學轉換的關系 按照HBcAg在肝內不同的表達類型分組，96周核苷類抗病毒治療后，HBeAg血清學轉換率在不同組間存在顯著差異(χ2=4.753，P=0.037)。按照不同HBcAg分級分組，HBeAg血清學轉換率同樣在不同組間存在顯著差異(χ2=6.580，P=0.016)(表2)。

2.4 抗-HBc定量在HBcAg不同類型患者的差異 ELISA結果顯示，血清IgM型抗-HBc、總抗-HBc在無表達型、核型、漿型和核漿型患者差異均有統計學意義(H=9.760，P=0.021；H=21.46，P<0.001)；血清IgM型抗-HBc、總抗-HBc在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級患者差異均有統計學意義(H=18.80，P<0.001；H=26.03，P<0.001)。組間進一步比較，無表達組血清IgM 抗-HBc表達明顯低于漿型表達組(P=0.003)(圖2a)；而在總抗-HBc表達上，無表達組低于漿型表達組(P=0.001)和核漿表達組(P<0.001)，核型表達組低于漿型表達組(P=0.036)和核漿表達組(P=0.005)(圖2b)。HBcAg病理Ⅱ、Ⅲ級患者IgM型抗-HBc水平高于Ⅰ級患者，Ⅲ、Ⅳ級的患者，其總抗-HBc水平高于Ⅰ級和Ⅱ級患者(P值均<0.05)(圖2c、d)。

表1 CHB患者基本資料

表2 不同HBcAg表達類型、分級的患者HBeAg血清學轉換情況

注：箭頭代表HBcAg陽性表達。

圖2 肝內不同HBcAg表達類型、分級患者血清抗-HBc的水平

2.5 HBcAg陽性的肝炎活動患者肝內差異基因表達 通過GSE96851基因表達芯片分析，發現HBcAg陽性的急性肝衰竭患者相對于對照組患者，肝內B細胞基因MS4A1(即CD20分子)和抗體相關基因(IGHA2、IGHD、IGHM、IGHV3、IGHV4-31、IGK、IGKC、IGKV1OR2-108、IGKV1OR2-118、IGLC1、IGLJ3、IGLL3P、IGLL5、IGLV1-44、IGSF6)有明顯上調表達。結果提示肝炎活動患者，肝內B細胞活化及抗體產生等免疫反應明顯激活(圖3)。

3 討論

據統計我國目前約有CHB患者3000萬，且每年約有30萬人死于乙型肝炎相關肝硬化、肝癌及終末期肝病，帶來沉重的經濟負擔[1]。目前核苷類藥物治療僅能有效抑制HBV的復制，而難以達到臨床治愈，探索并挖掘預測臨床療效的指標和分子機制，具有重要的臨床意義。在本研究中，對101例HBeAg陽性的CHB患者進行長期隨訪，發現抗病毒基線時CHB患者肝內HBcAg表達具有不同的表達類型及表達強度，漿型和核漿表達患者在核苷類抗病毒治療后HBeAg血清學轉換率較高，HBcAg表達強度為Ⅲ級患者HBeAg血清學轉換率也較高。

已有動物實驗[9-10]表明，B淋巴細胞在HBV感染的控制中發揮重要作用，而CHB患者體內HBV特異性B淋巴細胞功能明顯受到抑制或者損害，以至不能產生特異性抗體[11]。HBcAg具有強免疫原性，有利于機體免疫細胞的活化[12]，然而其主要在肝細胞內表達而極少分泌到外周血中，從而影響其對免疫的調節作用，與以往報道類似[13-15]。其中，漿型和核漿型表達患者，以及肝內HBcAg表達越高的患者，其血清中總抗-HBc和IgM型抗-HBc明顯升高，提示肝臟炎癥損傷時，HBcAg暴露或者釋放到血液循環中，激活了免疫細胞。因此，HBcAg在肝細胞的表達類型與表達水平，可能是影響患者免疫功能和抗病毒療效的因素之一。

近年來，不斷有文獻[16-17]報道血清抗-HBc定量檢測可以作為CHB患者接受核苷類或者干擾素治療后預測HBeAg血清學轉換的獨立危險因素，然而其中的相關機制尚未完全闡明。既往臨床實踐表明，HBcAg在血清中難以被檢測，主要原因在于其被HBsAg包裹而無法暴露，更難以直接刺激免疫細胞。有趣的是，本研究發現肝內HBcAg由細胞核向細胞胞漿表達的轉變中，與血清總抗-HBc和IgM型抗-HBc定量有明顯關系，推測HBV感染患者在肝炎波動時，肝細胞損傷后HBcAg由胞核向胞漿甚至是胞膜外暴露，激活機體免疫反應(尤其是B細胞反應產生HBV特異性抗體)，這在一定程度上解釋了抗-HBc定量預測CHB患者抗病毒治療后發生HBeAg血清學轉換的免疫學機制。

圖3 HBcAg陽性急性肝衰竭組織(4例)與對照肝組織(10例肝移植供者肝臟組織和7例血管瘤切除肝組織)肝內差異基因表達(數據來源于GSE96851)

綜上所述，HBcAg在肝細胞中的檢測對CHB患者核苷類藥物抗病毒療效預測具有重要作用。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：付喜花負責課題設計，資料分析，撰寫論文；黃璇、婁海波、毛玉巧參與收集數據，資料分析；沈國俊負責指導修改文章并最后定稿。