蟲草多糖對腫瘤壞死因子α誘導肝細胞凋亡的影響

趙佳男，彭景華，劉 平,2,3，胡義揚,2,3,4

1 上海中醫藥大學 肝病研究所，上海 201203； 2 上海市中醫臨床重點實驗室，上海 201203；3 肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海 201203； 4 上海中醫藥大學附屬曙光醫院 臨床藥理研究所，上海 201203

肝纖維化是指各種慢性肝病向肝硬化發展時肝臟損傷修復愈合反應的一種病理生理過程[1]，其中肝細胞凋亡在肝纖維化的形成過程中具有重要作用[2]。關于肝細胞凋亡與肝纖維化的聯系，目前主要有2種機制[3]：(1)肝細胞凋亡后產生的凋亡小體被肝臟中的Kupffer細胞、肝星狀細胞、肝竇周細胞吞噬，促進纖維化進展；(2)凋亡的肝細胞會釋放核苷酸腺苷三磷酸、脂質溶血磷脂膽堿等促纖維化介質從而促進肝纖維化。

目前國內已有多種中成藥應用于肝纖維化的治療，如扶正化瘀膠囊、鱉甲軟肝片等。這些方藥中大多含有蟲草菌絲或冬蟲夏草。筆者在既往針對扶正化瘀膠囊有效組分的研究[4-6]中發現，蟲草多糖具有顯著的抗肝纖維化作用，其可通過抑制肝星狀細胞活化和抑制TGFβ/Smads信號通路而發揮抗肝纖維化作用[7]，同時體內研究[8]也發現，蟲草多糖有抗肝細胞凋亡的作用，因此，本文擬運用體外TNFα誘導的L02細胞凋亡模型，進一步探討蟲草多糖對肝細胞凋亡的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株 人正常肝細胞株L02，購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。

1.1.2 實驗藥物 蟲草多糖(批號180316，純度≥45%UV)購自上海融禾醫藥科技發展有限公司，稱取0.028 g蟲草多糖，加入1 ml細胞全培養基后進行冰水浴超聲5 min混勻，配置為12.8 mg/ml的蟲草多糖母液儲存在超低溫冰箱備用，后續根據所需實驗藥物濃度進行配置。

1.1.3 實驗試劑 細胞培養基DMEM(1X，貨號11965-092，購自GibcoTM)；胎牛血清(貨號10099141C，購自GibcoTM)；青霉素和鏈霉素(10 000 U/ml，貨號15140122，購自GibcoTM)；PBS(貨號21-040-CV，購自Corning公司)；TNFα(貨號210-TA，購自美國R&D公司)；CCK8試劑盒(貨號CCK02-181102，購自上海博谷生物科技有限公司)；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒[貨號E606336-0100，購自生工生物工程(上海)股份有限公司]；兔cleaved-caspase3單克隆抗體(貨號9664)和兔cleaved-caspase8單克隆抗體(貨號9496)均購自cell signaling technology公司；兔GAPDH多克隆抗體(貨號10494-1-AP，購自Proteintech公司)；UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(貨號B511321-0100，購自生工生物工程上海股份有限公司)；TB Green Rremix Ex Taq(貨號PK0445，購自TaKaRa Bio公司)；iScriptTM cDNA Synthesis Kit(貨號1708891，購自TaKaRa Bio公司)；RT-PCR使用引物以及片段長度詳見表1。

表1 引物序列及片段長度

1.1.4 實驗儀器及設備 細胞孵育箱(型號Galasxy170s，購于美國NewBrunswick公司)；細胞超凈操作臺(型號HR50-IIA2，購自中國海爾公司)； PCR機(型號Applied Biosystems ViiA7，購自美國賽默飛公司)； Odyssey雙色紅外激光成像系統(購自Li-COR公司)；高內涵系統(購自美國賽默飛公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 L02正常肝細胞在提前配置好的完全DMEM培養基中培養，其中添加1%青霉素-鏈霉素和10%胎牛血清。于37 ℃、5%CO2的恒溫細胞培養箱中培養，取對數生長期，生長狀態良好的細胞進行后續實驗。

1.2.2 造模方法 將細胞按照所需組數接種于96孔板或6孔板，每孔細胞密度根據后續具體實驗方法進行選擇，TNFα造模濃度為0、5、10、20、40 ng/ml，干預時間為24 h，使用CCK8細胞增殖毒性檢測法和Annexin V/PI雙染法以確定最佳造模濃度。

1.2.3 細胞給藥 細胞按照所需組數接種于96孔板或者6孔板，蟲草多糖設置濃度為50、100、200 μg/ml共3組，在造模前預作用時間為12 h。

1.2.4 實驗分組 不經任何藥物和TNFα處理的正常培養細胞為正常組(N)，通過實驗篩選確定TNFα造模濃度并作用24 h的細胞為模型組(M)，根據實驗設計，50、100、200 μg/ml蟲草多糖預作用12 h并給予TNFα造模濃度作用24 h為實驗組。

1.2.5 檢測內容和方法

1.2.5.1 細胞增殖：CCK8法 細胞按照5×103/孔接種于96孔板，每組10孔，待細胞生長至80%以上時，棄上清，按照實驗設計進行分組并待藥物干預以及造模后，使用PBS緩沖液0.1 ml/孔清洗1次，加入CCK8工作液(CCK8試劑∶細胞全培養基=1∶10)0.1 ml/孔，然后于培養箱內繼續培養，選取最佳時間放入多功能酶標儀內(450 nm和630 nm波長)讀取各孔吸光度值。

1.2.5.2 肝細胞凋亡流式細胞儀檢測：Annexin V/PI雙染法 細胞按照2×106/孔接種于6孔板，每組3孔，待細胞生長至80%以上時棄上清，按照實驗設計進行分組并待藥物干預以及造模后，使用PBS洗滌收集不同組細胞，將細胞懸液搖勻后用195 μl的1×Binding Buffer重懸細胞；使細胞密度為2×105細胞/ml，分別加入5 μl的Annexin V和FITC染液至195 μl細胞重懸液，避光，混勻，4 ℃孵育15 min后進行上機檢測，為防止熒光衰變，在1 h內進行流式細胞檢測。

1.2.5.3 細胞凋亡內源性線粒體途徑(Bax、caspase9)、外源性死亡受體途徑(caspase8、Fas)和關鍵執行蛋白酶caspase3的mRNA表達：RT-PCR法 取生長狀態良好的細胞接種于6孔板，每組3孔，按照實驗設計進行分組并待藥物干預以及造模后，棄上清，使用PBS緩沖液清洗，加入Trizol裂解細胞，按照說明書使用總RNA抽提試劑盒進行細胞內總RNA提取，逆轉錄后進行RT-PCR檢測。

1.2.5.4 細胞內cleaved-caspase3、cleaved-caspase8蛋白表達:Western Blot法 將生長狀態良好的細胞接種于6孔板中，每組3孔，待藥物干預以及造模后，4 ℃預冷離心取細胞沉淀，加入60 μl RIPA細胞裂解液后置于冰上進行細胞總蛋白提取并使用100 ℃加熱器致蛋白變性3次，每次10 min后取相應樣本進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用Odyssey雙色紅外激光成像系統(Li-COR)進行蛋白印跡顯影并分析。

2 結果

2.1 TNFα誘導L02正常肝細胞凋亡模型的建立

2.1.1 不同濃度TNFα對L02肝細胞增殖的影響 以不同濃度(0、5、10、20、40 ng/ml)TNFα作用于L02細胞24 h，結果顯示，隨著濃度的增加，細胞增殖逐漸受到抑制，其中40 ng/ml濃度TNFα對L02細胞的增殖具有顯著抑制作用(P<0.01)(圖1)。

2.1.2 不同濃度TNFα對L02肝細胞凋亡數的影響 根據增殖實驗結果，選用0、20、40 ng/ml的TNFα濃度，通過Annexin V/PI雙染法檢測其誘導L02肝細胞24 h的細胞凋亡作用。結果顯示，細胞凋亡數量隨TNFα濃度升高而增加，其中40 ng/ml組與正常組比較差異具有統計學意義(9.85%±0.87% vs 7.71%±1.20%，P<0.05)(圖2)。因此，后續實驗以40 ng/ml的TNFα濃度作為誘導L02肝細胞凋亡的造模濃度。

注：與正常組比較，△△P<0.01。圖1 不同濃度TNFα對L02肝細胞增殖的影響

圖2 不同濃度TNFα對L02肝細胞凋亡數的影響

2.2 不同濃度蟲草多糖對TNFα誘導的L02肝細胞凋亡的影響

2.2.1 不同濃度蟲草多糖的肝細胞毒性試驗 CCK8法檢測結果顯示，與正常組比較，50、100、200 μg/ml的蟲草多糖均對L02肝細胞無明顯細胞毒性，其中100 、200 μg/ml蟲草多糖顯著促進L02肝細胞增殖(P值均<0.05)(圖3)。

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01。圖3 不同濃度蟲草多糖的肝細胞毒性試驗

2.2.2 不同濃度蟲草多糖對TNFα誘導L02肝細胞增殖的影響 與正常組比較，模型組細胞增殖活力顯著下降(P<0.05)，而50、100、200 μg/ml的蟲草多糖組增殖活力均顯著高于正常組和模型組(P值均<0.01)(圖4)。

2.3 不同濃度蟲草多糖對TNFα誘導L02肝細胞凋亡數的影響 Annexin V/PI雙染法檢測結果顯示，與正常組比較，模型組凋亡細胞數量顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，50、100、200 μg/ml蟲草多糖組凋亡細胞數量均明顯降低(P值均<0.05)；100 μg/ml組作用效果最優，其與200 μg/ml組比較差異有統計學意義(P<0.01)(圖5)。

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組M比較，**P<0.01。圖4 不同濃度的蟲草多糖對TNFα誘導L02肝細胞增殖的影響

2.4 不同濃度蟲草多糖對TNFα誘導L02肝細胞凋亡的mRNA表達影響 RT-PCR結果顯示，與正常組比較，模型組的內源性線粒體途徑(Bax)、外源性死亡受體途徑Fas的mRNA表達均顯著升高(P值均<0.05)；50、100、200 μg/ml的蟲草多糖均可顯著降低模型組內源性線粒體途徑caspase9的mRNA表達和關鍵執行蛋白酶caspase3的mRNA表達(P值均<0.05)；50、100 μg/ml的蟲草多糖可顯著降低Bax mRNA表達(P值均<0.05)；100、200 μg/ml的蟲草多糖可明顯降低Fas、caspase8 mRNA表達(P值均<0.05)(表3)

2.5 不同濃度蟲草多糖對TNFα誘導L02肝細胞凋亡的相關蛋白表達影響 與正常組比較，模型組cleaved-caspase3(P<0.05)、cleaved-caspase8(P<0.01)均顯著升高，200 μg/ml蟲草多糖組與模型組比較，cleaved-caspase3蛋白表達顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，50、100、200 μg/ml蟲草多糖組的cleaved-caspase8蛋白表達均明顯降低(P值均<0.01)(圖6)。

注：與正常組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與100 μg/ml組比較，&&P<0.01。圖5 不同濃度蟲草多糖對TNFα誘導L02肝細胞凋亡數的影響

表3 不同濃度蟲草多糖對TNFα誘導L02肝細胞凋亡的Bax、caspase 9、 caspase 8、Fas、caspase 3的mRNA表達影響

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖6 不同濃度蟲草多糖對TNFα誘導L02肝細胞凋亡的相關蛋白表達影響

3 討論

外源性死亡受體通路和內源性線粒體通路介導細胞凋亡的發生，外源性死亡受體途徑主要由TNF超家族成員介導，涉及半胱氨酸蛋白酶的層聯級激活，包括caspase8、caspase7、caspase10、caspase3。caspase3的激活導致肝細胞凋亡事件的發生，包括核DNA片段化，磷脂酰絲氨酸外露至細胞膜表面等。內源性線粒體途徑中線粒體促凋亡蛋白Bax通過拮抗抗凋亡蛋白Bcl2導致線粒體膜通透性改變，從而介導細胞色素C的釋放并激活caspase9和凋亡小體的形成，然后caspase9直接激活半胱氨酸蛋白酶3，后續步驟同外源性死亡受體途徑[9]。越來越多的研究[10]表明細胞凋亡的失調廣泛參與了各種疾病和病理過程，包括藥物毒性損傷、免疫反應所導致的損傷、感染以及腫瘤的發生、代謝紊亂、各種肝臟疾病等。

蟲草多糖是一種重要的機體穩態調節劑，基于肝細胞凋亡與肝纖維化的關系，本實驗重點研究蟲草多糖對TNFα誘導的肝細胞凋亡模型的具體影響以及作用機制。CCK8細胞增殖毒性實驗和流式細胞檢測結果顯示：(1)不同濃度的蟲草多糖對L02正常肝細胞均無明顯細胞增殖毒性，其中100、200 μg/ml蟲草多糖對L02正常肝細胞具有顯著的促增殖作用，且可以明顯恢復TNFα抑制的L02正常肝細胞的細胞增殖毒性；(2)100、200 μg/ml蟲草多糖能夠顯著減少TNFα誘導的細胞凋亡數量。此外，TNFα誘導L02正常肝細胞發生細胞凋亡的外源性途徑中死亡受體Fas的mRNA以及激活形式cleaved-caspase8的蛋白表達均升高，Fas被激活后可激活caspase8和細胞凋亡執行關鍵酶caspase3從而導致細胞凋亡；同時，對于內源性線粒體途徑，Bax作為重要的線粒體促凋亡蛋白，可導致線粒體功能障礙；關鍵酶caspase9功能與caspase8相近，同樣可激活caspase3導致細胞凋亡。TNFα誘導L02正常肝細胞Bax、caspase9、caspase3的mRNA和激活形式cleaved-caspase3的蛋白表達均升高，而100、200 μg/ml蟲草多糖可顯著抑制外源性途徑和內源性途徑中的Fas、caspase8、caspase9的mRNA以及激活形式cleaved-caspase8的蛋白表達，200 μg/ml蟲草多糖還可以顯著抑制激活形式cleaved-caspase3的蛋白表達，蟲草多糖對肝細胞凋亡的抑制作用可能隨藥物濃度升高而逐漸增強，因此，在安全藥物濃度的前提下，100、200 μg/ml可能是蟲草多糖抑制TNFα誘導肝細胞凋亡的最優濃度，未來仍需進一步實驗證實。

綜上所述，蟲草多糖抑制肝細胞凋亡的具體機制可能涉及如下：(1)抑制內源性線粒體途徑中的促凋亡相關蛋白功能，保護線粒體功能完整性；(2)抑制肝細胞凋亡相關的半胱氨酸蛋白酶激活；(3)抑制外源性死亡受體的表達。總之，該研究結果為蟲草多糖及其復方制劑在抗肝纖維化中的臨床應用提供了一定依據。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明:趙佳男負責撰寫論文；彭景華、劉平負責審校；胡義揚負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。