胰腺癌組織中L1細胞黏附分子和轉化生長因子β1的表達及意義

秦 雯，楊建宇，陳泰文，鄭海平，朱小東

1 廣西醫科大學附屬武鳴醫院 a.病理科，b.腫瘤科，南寧 530199； 2 廣西醫科大學附屬腫瘤醫院胃及腹部腫瘤病區，南寧 530021； 3 廣西醫科大學第一附屬醫院 腫瘤內科，南寧 530021

胰腺癌是一種具有高度侵襲性和致命性的消化系統惡性腫瘤，其不良預后主要與較早發生局部浸潤和遠處轉移有關[1]。自2000年起，我國胰腺癌的年齡標準化死亡率上升速度已居全球第2位[2]。因此，研究胰腺癌的發生以及促進其轉移、復發的關鍵因子，對于胰腺癌的治療以及預后改善具有重要意義。L1細胞黏附分子(L1 cell adhesion molecular，L1CAM)是一種分子量為200～220 kDa的跨膜糖蛋白分子，屬于細胞黏附分子免疫球蛋白超家族的一員，在神經組織的發育和再生中發揮重要作用[3-4]，近年來，L1CAM被發現表達于許多腫瘤細胞系與腫瘤組織中[5]，且其高表達往往提示患者預后不良[6-7]。轉化生長因子β1(TGFβ1)是一種多功能的細胞生長因子，在促進腫瘤血管形成、細胞外基質合成、免疫抑制、損傷修復、纖維化[8]和腫瘤[9-13]的發生中發揮重要作用[14]。本研究通過分析胰腺癌組織中L1CAM和TGFβ1表達情況與患者臨床病理參數及預后的關系，旨在探討L1CAM和TGFβ1在胰腺癌發生、發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2015年1月—2018年1月于廣西醫科大學第一附屬醫院、廣西醫科大學附屬腫瘤醫院、廣西醫科大學附屬武鳴醫院行手術切除的胰腺癌患者為研究對象，收集患者的組織學標本(包括癌組織及癌旁組織標本)、臨床及隨訪資料。納入標準：(1)經病理學檢查確診為胰腺導管腺癌；(2)術前均未接受過化療、放療。排除標準：(1)既往惡性腫瘤史、自身免疫性疾病及血液系統疾病；(2)合并嚴重的心、腦、肺、腎等基礎疾病；(3)精神、智力或神經功能障礙，無法配合臨床試驗者。

1.2 隨訪方法 自術后開始隨訪，在門診及住院記錄中收集所有患者的隨訪信息，配合電話隨訪，隨訪截止日期為2021年1月，共隨訪1～36個月，直至患者死亡或隨訪截止。

1.3 免疫組化染色及評分 將石蠟標本連續切片后置于恒溫烘箱內烤片，切片經二甲苯脫蠟和水化后加入檸檬酸緩沖液進行微波修復；3% H2O2浸泡10 min后PBS洗滌3次，滴加山羊血清封閉10 min；滴加一抗(L1CAM、TGFβ1的最佳稀釋濃度分別為1∶200、1∶100)并于4 ℃孵育過夜，以PBS代替一抗為陰性對照。次日，PBS沖洗玻片，滴加二抗于室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，DAB顯色5 min，自來水終止顯色，蘇木素復染；酒精鹽酸溶液分化5 s，自來水中沖洗20 min藍化；無水酒精脫水，中性樹脂封片。隨機選取5個200倍視野，每個視野均進行染色強度計分與陽性百分比計分，根據陽性細胞所占比例和染色強度綜合判斷L1CAM、TGFβ1的表達情況。(1)根據細胞染色強度計分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；(2)根據陽性細胞百分數計分：無陽性細胞為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分，將2項得分結果相乘：總分≤3分為低表達，>3分為高表達。所有切片結果均由2名病理科醫師獨立雙盲下完成結果判讀。

1.4 倫理學審查 本研究經由廣西醫科大學附屬武鳴醫院倫理委員會批準，批號：倫審WM-2019(101)。所有患者均簽署書面知情同意書。

2 結果

2.1 一般資料 共納入胰腺癌患者125例，其中男69例，女56例；年齡46～82歲，平均年齡(62.06±8.27)歲，其中<60歲53例，≥60歲72例。腫瘤直徑≤2 cm 23例，2 cm<腫瘤直徑≤4 cm 85例，腫瘤直徑>4 cm 17例；腫瘤部位：位于胰頭79例，位于胰體尾46例；病理分化程度：低分化49例，中分化55例，高分化21例；TNM分期：I期23例，Ⅱ期50例，Ⅲ期～Ⅳ期52例；有神經侵犯54例，無神經侵犯71例；有淋巴結轉移62例，無淋巴結轉移63例；有脈管內癌栓58例，無脈管內癌栓67例。

2.2 L1CAM和TGFβ1在胰腺癌組織及癌旁組織中的表達情況 L1CAM染色和TGFβ1染色均主要分布于細胞質，染色呈棕色及棕黃色顆粒樣(圖1、2)。125例胰腺癌組織中94例(75.20%)L1CAM蛋白高表達，31例(24.80%)L1CAM蛋白低表達(含不表達)；癌旁組織中25例(20.00%)L1CAM蛋白高表達，100例(80.00%)L1CAM蛋白低表達(含不表達)。125例胰腺癌組織中102例(81.60%)TGFβ1蛋白高表達，23例(18.40%)TGFβ1蛋白低表達(含不表達)；癌旁組織中29例(23.20%)TGFβ1蛋白高表達，96例(76.80%)TGFβ1蛋白低表達(含不表達)。L1CAM、TGFβ1在胰腺癌組織中表達均高于癌旁組織，差異均有統計學意義(χ2值分別為76.352、85.461，P值均<0.001)。

2.3 L1CAM和TGFβ1表達水平與臨床病理特征的聯系 根據L1CAM表達水平分為L1CAM高表達組(n=94)和低表達組(n=31)，2組間腫瘤大小、部位、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、脈管內癌栓、神經侵犯比較差異均有統計學意義(P值均<0.05)；根據TGFβ1表達水平分為TGFβ1高表達組(n=102)和低表達組(n=23)，2組間腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、脈管內癌栓、神經侵犯比較差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表1)。

注：a，胰腺癌組織，高表達；b，癌旁組織，不表達。圖2 胰腺癌組織及癌旁組織中TGFβ1的表達情況(免疫組化，×200)

2.4 胰腺癌中L1CAM和TGFβ1蛋白表達的相關性 Spearman相關性分析顯示，胰腺癌組織中L1CAM和TGFβ1共同高表達者87例，共同低表達者16例，L1CAM高表達而TGFβ1低表達者7例，TGFβ1高表達而L1CAM低表達者15例，兩者在胰腺癌中的表達呈正相關(r=0.492，P<0.001)。

2.5 Cox風險比例模型分析結果及生存分析 Cox單因素和多因素風險回歸模型分析顯示，患者的生存時間與腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、脈管內癌栓、神經侵犯、遠處轉移、L1CAM蛋白表達、TGFβ1蛋白表達相關(P值均<0.05)，其中TNM分期是胰腺癌患者的獨立危險因素(P值均<0.05)(表2)。Kaplan-Meier生存曲線進一步分析顯示，L1CAM或TGFβ1蛋白高表達胰腺癌患者生存時間顯著縮短，差異有統計學意義(χ2值分別為54.661、39.597，P值均<0.001，圖3)。

3 討論

CAM是介導細胞間或細胞與細胞外基質間相互接觸和結合的一系列糖蛋白分子，參與細胞的信號傳導與活化、細胞的伸展和移動、腫瘤轉移、創傷愈合等一系列重要生理及病理過程。L1CAM屬于CAM中的免疫球蛋白超家族成員，由1257個氨基酸構成，其胞外區含有6個免疫球蛋白樣區域(Ig1～6)和5個纖連蛋白Ⅲ(Fibronectin Ⅲ，FNⅢ)樣區域(Fn1～5)。L1CAM作為黏附分子能增加腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，具體表現為促進腫瘤細胞跨越內膜、侵犯基底膜、轉移至其他部位，因此在腫瘤發展和轉移過程中發揮重要作用[15]。研究表明，L1CAM在膠質母細胞瘤[16]、腦轉移性腫瘤[17]、子宮內膜樣腺癌[18]、結直腸癌[19-20]、肺癌[21]等多種原發性或轉移性腫瘤中呈上升趨勢，是有價值的診斷或預后標志物，也可能成為癌癥治療的新靶點[6]。由于L1CAM屬于間質標志物，因此其表達水平的升高提示其促腫瘤的作用可能通過上皮-間質轉化而實現。而上皮-間質轉化也可看作是一個去分化的過程，與腫瘤干細胞特性的獲得有關。腫瘤干細胞代表腫瘤細胞中的一小部分，但表現出獨特的自我更新能力，并通過不對稱細胞分裂產生更多有差異的細胞，從而促進腫瘤的異質性，是腫瘤發生以及治療后復發必不可少的環節[22-23]。

TGFβ是一種多功能細胞因子，在哺乳動物中存在3種同源亞型(TGFβ1～3)，其中TGFβ1是表達最豐富的亞型。TGFβ1基因位于染色體19q13.2區，由7個外顯子組成，被6個較大的內含子分隔[14]。機體對TGFβ1的調控發生在多個環節，包括轉錄、翻譯、分泌和細胞外環境的活化。在腫瘤組織中，TGFβ1可促進血管形成、抑制免疫系統而使腫瘤細胞逃避殺傷、改變腫瘤細胞與周圍細胞的黏附性從而促進其生長和轉移[13]。

本研究結果顯示，75.20%的胰腺癌組織中 L1CAM蛋白高表達，20.00%的癌旁組織中L1CAM蛋白高表達，胰腺癌組織中L1CAM蛋白高表達率顯著高于癌旁組織；81.60%的胰腺癌組織TGFβ1蛋白高表達，23.20%的癌旁組織TGFβ1蛋白高表達，胰腺癌組織中TGFβ1蛋白高表達率顯著高于癌旁組織。Spearman相關性分析顯示，L1CAM蛋白和TGFβ1蛋白在胰腺癌中的表達呈正相關，提示在胰腺癌發生發展過程中，二者可能產生協同作用，二者的表達可能對胰腺癌的進程發揮著重要的影響。關于L1CAM和TGFβ1蛋白在腫瘤進展中的協同作用在結直腸癌的研究[24]中曾有報道，通過觀察慢性炎癥性腸病發展為結直腸癌的病例發現，在腸道黏膜慢性炎癥時，巨噬細胞顯著富集，且其分泌的細胞因子(如TGFβ1)增加。

表2 Cox風險回歸模型分析胰腺癌患者3年生存情況與臨床病理參數的關系

結直腸活組織檢查的免疫組化顯示，慢性炎癥性腸病患者的腸上皮細胞中有大量L1CAM表達，而正常結直腸組織中則沒有。在體外實驗中，TGFβ1可上調大腸上皮細胞系NCM460中L1CAM的表達，從而增強細胞運動性和凋亡抵抗能力。因此，筆者推測在胰腺癌中L1CAM和TGFβ1蛋白也可能通過類似的分子通路產生協同作用，進而促進胰腺癌的發生發展。此外，本研究分析了L1CAM蛋白、TGFβ1蛋白表達與患者臨床病理特征的關系，結果顯示，L1CAM蛋白和TGFβ1蛋白表達均與腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、脈管內癌栓和神經侵犯有關，提示二者與胰腺癌患者疾病進展密切相關，且均可能促進腫瘤細胞的淋巴道轉移和血行轉移。Cox風險回歸模型分析顯示，患者的生存時間與腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、脈管內癌栓、神經侵犯、遠處轉移、L1CAM蛋白表達、TGFβ1蛋白表達相關。Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，L1CAM蛋白高表達患者或TGFβ1蛋白高表達患者總生存率顯著低于低表達患者，提示L1CAM蛋白和TGFβ1蛋白表達與生存情況密切相關。L1CAM蛋白和TGFβ1蛋白高表達影響患者生存預后，可能與其促進淋巴道轉移、血行轉移等因素有關。

綜上所述，L1CAM蛋白和TGFβ1蛋白在人胰腺癌組織內高表達，且與淋巴道轉移、血行轉移及預后不良有關，在腫瘤發生發展及轉移過程中產生了重要的影響。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：秦雯負責課題設計，資料分析，撰寫論文；楊建宇、陳泰文、鄭海平參與收集數據，修改論文；朱小東負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。