鹿胎肽對巨噬細胞RAW264.7的免疫調節作用

張凱月，李春楠，蘭 夢，王亞蘋，尹馨雪，張 輝，高曉晨

(長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院，吉林長春130117)

生物活性肽(Bioactive Peptides，BAP)是指對生物機體的生命活動有益或是具有生理作用的肽類化合物，其分子結構復雜程度不一，含有2～20個氨基酸的特異性蛋白片段，可通過磷酸化、糖基化或酰基化而被修飾［1］。現代研究表明，胎盤中含有多種活性成分，如生物活性肽、免疫球蛋白、氨基酸、礦物質等其他成分，是一種較為理想的免疫調節劑，其作用機制為通過調控巨噬細胞吞噬和抗原遞呈功能以及相關細胞因子的表達，從而參與巨噬細胞免疫應答反應［2－3］。巨噬細胞是機體免疫系統的重要細胞之一，具有吞噬、表達相應抗原遞呈分子、分泌多種細胞因子等功能，在機體廣泛參與清除病原微生物與衰老細胞，發揮免疫調節作用，以維持機體內環境的穩態，在天然免疫中起重要作用［4］。另有研究表明，生物活性肽類成分在免疫調節及抗氧化等方面表現出了重要的生理活性［1］。鄧志程等［5］以馬氏珠母貝為原料，酶解后經多級分離純化后得到兩種寡肽，通過體外研究發現兩種寡肽能明顯促進對RAW264.7細胞的吞噬功能，表達其免疫調節作用。

鹿胎為鹿科動物梅花鹿(Cervus nippon Temminck)或馬鹿(Cervus elaphus Linnacus)的胎盤和胎獸［6］。近年來的研究表明，鹿胎制劑在抗氧化、免疫調節、抗炎方面表現出良好的活性［7－9］。韓廣金等［10］用鹿胎制劑觀察大鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的現象，證明鹿胎制劑可顯著提高大鼠巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數。然而對鹿胎中提取的生物活性肽的藥理作用研究報道甚少。本實驗以鹿胎為原料，通過閃式提取法和超濾的方法制備鹿胎肽，而后根據其對RAW264.7細胞的生長與增殖、細胞形態、吞噬作用、NO分泌和細胞因子分泌及細胞周期的影響，評價其免疫調節作用，以期為鹿胎肽(Deer fetus peptides，DFP)的進一步研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹿胎 吉林省東鰲鹿業科技開發有限公司;牛血清白蛋白 上海源葉生物科技有限公司;DMEM高糖培養基 美國 Gibco公司;脂多糖(lipopolysaccharides，LPS) 上海源葉生物科技有限公司;噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT) 美國Amresco公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)天津市光復精細化工研究所;NO試劑盒、白介素(interleukin，IL)－1β試劑盒、IL－6試劑盒、腫瘤壞死因子－α(tumor necrosis factorα，TNF－α)試劑盒 長春百金生物科技有限公司;中性紅細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒 碧云天生物技術有限公司;細胞周期檢測試劑盒 貝博生物科技有限公司;其余試劑 均為國產分析純。

HERAEUS HERAcell 150 CO2培養箱 日本三洋公司;Model 680型酶標儀 日本TAKARA公司;CX 23熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司;JHBE－50T閃式提取器 北京金洋萬達科技有限公司;XL90超濾離心機 Beckman公司;GZLY－0.4型藥用真空冷凍干燥機 北京速原中天科技有限公司;BD Facscalibur流式細胞儀 美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹿胎肽的提取及蛋白含量的測定

1.2.1.1 鹿胎的預處理 將鮮鹿胎洗凈，絞碎，放置于通風陰暗處陰干，粉碎，過180目篩，即得鹿胎粗粉末。

1.2.1.2 鹿胎肽的提取 取鹿胎粗粉40 g，加入25倍量的水，混勻，用閃式提取器提取10次，每次10 s，所得提取液在3600 r/min下離心10 min，將上清液抽濾，過0.45μm微膜除雜，然后用超濾離心機進行超濾分級，實驗選用1、3、10 kDa的超濾膜，將提取液分為總提液、大于10、3～10、1～3 kDa、小于1 k Da五個分子質量段的超濾液分別命名為DFP－1、DFP－2、DFP－3、DFP－4、DFP－5凍干備用。

1.2.1.3 鹿胎肽蛋白含量測定 參考Bradford法測定鹿胎肽的蛋白含量［11－12］。標準曲線的建立:精密稱取1.0 mg牛血清白蛋白(BSA)于10 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度。分別取標準液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于干燥試管中，每管補充蒸餾水至1.0 mL。分別加入考馬斯亮藍試劑5 mL，快速渦旋混勻，室溫反應5 min，以空白組調零，5～20 min內測定其在595 nm處的吸光度值，繪制標準曲線。

樣品測定:將5個樣品配制成質量濃度為1 mg/mL溶液，取1 mL加入考馬斯亮藍試劑5 mL，快速渦旋混勻，室溫反應5 min，5～20 min內測定其在595 nm處的OD值。

蛋白 質含量(mg/mL)=(Ai－0.0443/6.8665)×Cs

式中:Ai表示樣品于595 nm處測得的OD值，Cs表示牛血清白蛋白濃度

1.2.2 鹿胎肽對RAW264.7巨噬細胞增殖作用的影響

1.2.2.1 不同超濾組分對RAW264.7細胞的增殖作用 采用MTT法測定RAW264.7細胞的增殖能力［13－14］。取對數生長期細胞以105個/孔于96孔培養板，每孔150μL，37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，待細胞貼壁后，棄去上清液，分別加入100μg/mL的DFP－1、DFP－2、DFP－3、DFP－4、DFP－5溶液150μL，空白對照組為150μL含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，陽性對照組為10μg/mL LPS 150μL，每組5個復孔。在37℃、5%CO2條件下分別培養12、24、48 h，棄去上清液，每孔加入5 mg/mL的MTT 10μL，4 h后加入DMSO 150μL，振蕩5 min，于490 nm波長處測其OD值。計算細胞增殖指數［15］。

細胞增殖指數=As/Ac

式中:As表示實驗組OD值，Ac表示空白對照組OD值。

1.2.2.2 不同質量濃度DFP－5對RAW264.7細胞的增殖作用 按“1.2.2.1”項下方法，分別加入6.25、12.5、25、50、100、200、400μg/mL的DFP－5溶液150μL，空白對照組為150μL含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，陽性對照組為10μg/mL LPS 150μL，每組5個復孔。在37℃、5%CO2條件下培養24 h，棄掉培養上清液，每孔加入5 mg/mL的MTT 10μL，4 h后加入DMSO 150μL，振蕩5 min，于490 nm波長處測其OD值。計算細胞增殖指數。

1.2.2.3 熒光倒置顯微鏡觀察 取對數生長期細胞以105個/孔，每孔2 mL接種于6孔板，37℃、5%CO2培養箱孵育24 h后，吸出培養液，加入質量濃度為12.5、25、50、100、200μg/mL的DFP－5，以LPS(10μg/mL)為陽性對照組，同時設置空白組;孵育24 h后，加入90%DAPI熒光染料染色，室溫染色5 min，吸除DAPI染色液，用pH7.2磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次，用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照［16］。

1.2.2.4 中性紅吞噬實驗 取對數生長期細胞以105個/孔，每孔150μL于96孔板中，37℃、5%CO2培養箱孵育24 h后，棄去培養液，并給予質量濃度為12.5、25、50、100、200μg/mL的DFP－5藥物刺激，每組5個復孔，同時設定LPS組和空白組，孵育24 h。吸出上清液，PBS洗滌2次，隨后加入200μL細胞培養液，同時加入中性紅染液20μL，孵育2 h。除去含有中性紅染液的細胞培養液，PBS洗滌1次，于每孔加入中性紅檢測裂解液200μL，室溫搖床上裂解10 min。于540 nm波長處測定OD值，計算細胞吞噬指數［17－18］。

細胞吞噬指數=As/Ac

式中:As表示實驗組OD值，Ac表示空白對照組OD值。

1.2.2.5 DFP－5對RAW264.7細胞NO分泌量的影響 將對數生長期RAW264.7細胞接種于96孔培養板，每孔體積200μL，密度為105個/孔，于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，待細胞貼壁后，棄去上清液，分別加入12.5、25、50、100、200μg/mL的DFP－5樣品溶液150μL，設置空白組和LPS組，每組5個復孔。于37℃、5%CO2條件下培養24 h后，取上清液150μL，按NO試劑盒說明書測定NO的分泌量。

1.2.2.6 DFP－5對RAW264.7細胞的細胞因子釋放的影響 RAW264.7細胞的處理方法同“1.2.2.5”節，在37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后，取上清液150μL，按ELISA試劑盒說明書測定各因子IL－1β、IL－6、TNF－α的分泌量。

1.2.2.7 DFP－5對RAW264.7細胞周期的影響 細胞濃度約為105個/mL，每孔2 mL接種于6孔板中，24 h后吸出培養液，分別加入質量濃度為12.5、25、50、100、200μg/mL的DFP－5，同時設置LPS組和空白組，繼續孵育，收集樣本細胞，細胞數量約為6×106個，用冷PBS洗滌2次，吹散細胞至15 mL離心管中，1000 r/min離心5 min，棄去上清液，用500μL PBS重懸細胞，滴加3 mL 75%冷乙醇，放入－20℃固定1 h，離心，500μL冷PBS重懸細胞，加RnaseA溶液20μL，37℃水浴30 min，離心10 min，棄上清，加入PI染液400μL，輕輕混勻后4℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測其結果［19－20］。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 鹿胎肽蛋白含量測定

以牛血清白蛋白質量濃度(X)為橫坐標，以吸光度OD值(Y)為縱坐標，繪制標準曲線如圖1。經公式計算得DFP－1、DFP－2、DFP－3、DFP－4、DFP－5溶液的蛋白含量分別為0.4326、0.2914、0.3160、0.3926、0.3460 mg/mL。

圖1 牛血清白蛋白標準曲線Fig.1 Bovine serum albumin standard curve

2.2 不同超濾組分對RAW264.7細胞的增殖作用

從表1中可知，DFP各超濾組分對RAW264.7細胞的增殖均有一定的促進作用;當RAW264.7細胞培養12 h后，DFP－1、DFP－2、DFP－3組分對RAW264.7細胞增殖的促進作用具有顯著性差異(P＜0.05)，DFP－4、DFP－5組分以及LPS組對RAW264.7細胞的促進作用具有極顯著性差異(P＜0.01)。當RAW264.7細胞培養24、48 h后，5種樣品以及LPS組與空白組相比均有極顯著性差異(P＜0.01)，培養時間在24 h時，各組分的增殖能力最強，故后續細胞培養時間均為24 h，且DFP－5組分對RAW264.7細胞的增殖作用與陽性最為接近，因此選擇DFP－5做進一步研究。

2.3 不同質量濃度DFP－5對RAW264.7細胞的增殖作用

由圖2可知，LPS和DFP－5均能促進RAW264.7細胞的增殖，在質量濃度為6.25～400μg/mL的范圍內，RAW264.7細胞的增值指數呈先上升后下降的趨勢。當DFP－5質量濃度為12.5、200μg/mL時，對RAW264.7細胞增殖影響顯著(P＜0.05);當DFP－5質量濃度為25、50、100μg/mL時，對RAW264.7細胞增殖的影響極顯著(P＜0.01)，且25μg/mL質量濃度時增殖指數最大，為1.95±0.09。隨著DFP－5質量濃度的繼續增加，增殖指數開始驟降，當質量濃度升至400μg/mL時，與空白對照組相比，DFP－5對RAW264.7細胞增殖的影響已無統計學意義(P＞0.05)，故選擇12.5～200μg/mL DFP－5進行免疫調節機制的進一步研究。

圖2 不同質量濃度DFP－5對RAW264.7細胞增殖能力的影響(n=5)Fig.2 Effects of different concentrations of DFP－5 on the proliferation of RAW264.7 cells(n=5)

2.4 熒光倒置顯微鏡觀察

由圖3可以看出，與空白組相比，不同質量濃度DFP－5與LPS組處理后細胞在數量上發生明顯的變化。隨著DFP－5從12.5～50μg/mL質量濃度的不斷增加，細胞數量也明顯增多，但質量濃度為100μg/mL時，數量開始慢慢變少。質量濃度為25μg/mL時，與LPS組數量最為接近。

圖3 熒光倒置顯微鏡觀察細胞形態(400×)Fig.3 Morphology of RAW264.7 cells observed by fluorescence inverted microscope(400×)

2.5 中性紅吞噬實驗結果

由圖4可得，LPS組和質量濃度為12.5、25、50μg/mL的DFP－5均能極顯著增強RAW264.7細胞的吞噬能力(P＜0.01)，且隨著質量濃度的增加，對RAW264.7細胞吞噬能力的刺激作用呈先上升后下降的趨勢。當質量濃度增至25μg/mL時，吞噬指數達到1.87±0.12，表明DFP－5能有效激活RAW264.7細胞發揮吞噬作用。

圖4 不同質量濃度DFP－5對RAW264.7細胞吞噬能力的影響(n=5)Fig.4 Effects of different concentrations of DFP－5 on the phagocytosis of RAW264.7 cells(n=5)

2.6 DFP－5對RAW264.7細胞NO分泌量的影響

NO作為重要的作為一種重要的信號傳導介質，參與多種生理活動和病理過程，其與免疫系統存在密切關系。NO在免疫調節方面具有雙重作用，一方面NO是不可或缺的調節因子;另一方面，過量NO會誘導炎性因子的產生，引起炎癥，導致組織損傷［21］。試驗細胞分泌NO的變化由圖5可知，DFP－5對RAW264.7細胞NO分泌量的刺激作用與劑量相關，隨著質量濃度的不斷增加，NO釋放量呈先上升后下降的趨勢，其中，DFP－5質量濃度為25μg/mL時，細胞NO的分泌量達最大值，為(21.57±1.80)μmol/L;DFP－5各質量濃度對細胞NO分泌量均具有極顯著性差異(P＜0.01)，但弱于LPS組。試驗中DFP－5極顯著增加了巨噬細胞釋放NO的能力(P＜0.01)，可以認定為DFP－5是巨噬細胞的免疫調節物質，具有免疫調節活性。

圖5 不同質量濃度DFP－5對RAW264.7細胞NO分泌量的影響(n=5)Fig.5 Effects of different concentrations of DFP－5 on NO secretion in RAW264.7 cells(n=5)

2.7 DFP－5對RAW264.7細胞的細胞因子釋放的影響

圖6 不同質量濃度DFP－5對RAW264.7細胞IL－1β、IL－6、TNF－α分泌量的影響(n=5)Fig.6 Effect of different concentrations of DFP－5 on the secretion of in IL－1β、IL－6、TNF－αin RAW264.7 cells(n=5)

圖7 RAW264.7細胞周期的變化Fig.7 Changes in cell cycle of RAW264.7 cells

免疫活性肽具有多方面的生理功能，不僅能增強機體的免疫能力，在動物體內起重要的免疫調節作用;而且還能刺激機體淋巴細胞的增殖和增強巨噬細胞的吞噬能力，提高機體對外界病原物質的抵抗能力［22］。IL－1β、IL－6和TNF－α是介導炎癥發生的主要因子，這些炎癥因子可以激活免疫細胞而起到免疫調節作用［23－24］。DFP－5對RAW264.7細胞分泌細胞因子的影響由圖6所示，DFP－5對RAW264.7細胞中細胞因子分泌量的影響與劑量呈相關性。經25μg/mL DFP－5處理后，細胞因子IL－1β、IL－6和TNF－α的分泌量與空白組相比均有極顯著性作用(P＜0.01)，且其各因子的分泌量最高，趨近于陽性對照組。表明DFP－5可極顯著促進各細胞因子分泌(P＜0.01)，發揮免疫調節作用。

2.8 DFP－5對RAW264.7細胞周期的影響

由圖7、圖8可知，與空白對照組相比，經DFP－5處理24 h后，G0/G1期的細胞比例呈先上升后下降的趨勢，處于S期及G2/M期的細胞與總細胞數中的占比呈先下降后上升的趨勢，且比例呈劑量相關性。當DFP－5質量濃度達到25μg/mL時，各時期的變化趨勢與LPS組最接近。

3 結論

本實驗研究發現DFP－5在體外細胞實驗中表現出較強的增殖活性，能夠促進RAW264.7巨噬細胞釋放NO、IL－1β、IL－6和TNF－α等細胞因子的釋放。同時，本研究同時進行細胞周期檢查，DFP－5能明顯提高G0/G1細胞比例，G0/G1為RNA和蛋白質的合成期，因此相關蛋白的表達量增加，所以吞噬作用、NO及細胞因子的分泌能力在此時期分泌量達最大值。因此，DFP－5可以作為天然免疫調節劑應用到食品及保健品領域中。同時，該項研究也為進一步開發鹿胎生物活性成分提供了理論依據和參考價值。

圖8 DFP－5對RAW264.7細胞周期的影響Fig.8 Effects of different concentrations of DFP－5 on cell cycle of RAW264.7 cells