三種HPV-DNA檢測法在篩查高危型HPV感染中的應用效果

陸妹英

（柳州市工人醫院，廣西 柳州 545005）

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。相關的調查數據顯示，宮頸癌的發病率排在全球女性惡性腫瘤發病率的第四位。宮頸癌患者在發病的初期無特異性癥狀，其病情易被誤診為其他疾病。多數此病患者的病情被確診時往往已經進展至中晚期，進而延誤了治療的時機[1]。對宮頸癌患者的病情進行早期篩查及確診對改善其預后具有重要的意義。大量的流行病學及分子生物學研究結果顯示，持續存在的高危型人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染是導致宮頸癌及宮頸癌癌前病變的主要病因[2]。HPV是一種無包膜病毒，由8000個堿基對組成的雙鏈環狀DNA及正二十面體蛋白質衣殼組成。HPV感染可分為黏膜表面感染和皮膚感染[3]。本次研究主要探討三種HPV-DNA檢測法在篩查高危型HPV感染中的應用效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究的對象為2019年1月至2020年10月期間在柳州市工人醫院接受婦科檢查的21 965例受檢者。這21 965例受檢者均知曉本次研究的內容，并簽署了參加本次研究的知情同意書。本次研究對象的排除標準是：1）臨床資料不全者。2）中途退出本次研究者。這21 965例受檢者的年齡為19～99歲，平均年齡為（65.6±9.4）歲。按照檢測方法的不同將這21 965例受檢者分為DH3法組（n=12 648）、HPV原位雜交法組（n=5）和實時熒光定量PCR法組（n=9312）。本次研究獲得了柳州市工人醫院醫學倫理委員會的批準。

1.2 研究方法

對DH3法組受檢者使用DH3法進行HPV-DNA檢測，方法是：1）采集受檢者宮頸部位的脫落細胞作為檢測標本。2）將檢測標本滴入DH3 HPV核酸檢測試劑盒的捕獲微孔板中，嚴格按照試劑盒的質控要求進行操作。3）根據試劑盒底物的光強度判斷HPV-DNA的數量。對HPV原位雜交法組受檢者使用HPV原位雜交法進行HPV-DNA檢測，方法是：1）用一次性宮頸軟毛刷采集受檢者宮頸部位的脫落細胞放入標本瓶中。2）用過濾器濾出細胞后移至載玻片上，采用三步法對細胞涂片進行染色。先在細胞涂片上加入地高辛抗體識別地高辛并標記靶點，再加入兔抗鼠抗體與地高辛抗體進行結合，然后加入辣根過氧化物酶檢測試劑。將3.3-二氨基聯苯胺（DAB）作為顯色底物，對細胞涂片進行顯色后，根據雜交信號的有無判斷是否感染HPV。當細胞核呈黃色、棕黃色或棕褐色著色、但細胞質和細胞膜無著色時即可判定HPV陽性。對實時熒光定量PCR法組受檢者使用實時熒光定量PCR法進行HPV-DNA檢測，方法是：1）采集受檢者宮頸部位的脫落細胞作為檢測標本。2）使用實時熒光定量PCR儀及配套試劑盒對檢測標本進行HPV-DNA檢測。對三組受檢者中HPV-DNA檢測結果呈陽性者進行陰道鏡活檢，方法是：1）對受檢者的陰道進行清潔、消毒后，使用活檢鉗咬取其可疑病變部位一定量的組織作為標本送至病理科。要求患者在采集標本前的3 d內無性交活動及陰道用藥史，且處于非月經期。2）對組織標本進行切片、包埋、染色處理后，觀察其細胞和組織的形態結構變化的情況。3）根據患者組織標本的細胞及組織形態結構，判定其是否發生HPV感染及HPV感染的程度[4]。

1.3 觀察指標

觀察三組受檢者進行陰道鏡活檢結果與進行HPV-DNA檢測結果的符合率。符合率﹦陰道鏡活檢高危型HPV感染的例數∕HPV-DNA檢測陽性的例數×100%。

1.4 統計學處理

對本次研究中的數據均采用SPSS 18.0統計軟件進行處理，計量資料用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，計數資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

進行陰道鏡活檢的結果為，DH3法組中高危型HPV感染者有546例患者，HPV原位雜交法組中高危型HPV感染者有5例，實時熒光定量PCR法組中高危型HPV感染者有332例。DH3法組受檢者陰道鏡活檢結果與HPV-DNA檢測結果的符合率為89.22%（546∕612），HPV原位雜交法組受檢者陰道鏡活檢結果與HPV-DNA檢測結果的符合率為100%（5∕5），實時熒光定量PCR法組受檢者陰道鏡活檢結果與HPV-DNA檢測結果的符合率為93.26%（332∕356）。詳見表1。

表1 三組受檢者檢測結果的比較

3 討論

相關的調查結果顯示，有90%以上的宮頸癌患者是由高危型HPV感染所致[5]。宮頸癌患者在發病的初期會出現接觸性出血、陰道排液異味等癥狀，當其病情發展至中晚期還會出現不規則陰道流血及感染等癥狀。目前，臨床上檢測HPV-DNA的方法有DH3法、HPV原位雜交法和實時熒光定量PCR法等。DH3 HPV核酸檢測試劑盒是一種快速HPV-DNA檢測試劑盒。該試劑盒中的變性試劑可使宮頸脫落細胞HPV的雙鏈DNA變性分解成單鏈DNA，單鏈DNA可與特異性RNA探針結合為DNA-RNA雜合體，DNARNA雜合體與捕獲微孔板上的特異性抗體相結合后，與偶聯堿性磷酸酶的抗DNA-RNA雜合體中的特異性抗體相結合后會在酶促反應下發光，然后觀察者可根據底物的光強度判斷HPV-DNA的數量。DH3 HPV核酸檢測試劑盒中的特異性RNA探針可與HPV的14種亞型相結合，形成14種DNA-RNA雜合體，能夠有效地避免假陰性及假陽性檢測結果的產生，適用于對宮頸疾病的初步篩查及定性監測。HPV原位雜交法主要是通過三步法對細胞涂片進行染色，再將DAB作為顯色底物對細胞進行顯色，然后根據雜交信號的有無判斷是否感染HPV，當細胞核呈黃色、棕黃色或棕褐色著色、但細胞質和細胞膜無著色時即可判定HPV陽性。HPV原位雜交法可以準確定位HPV細胞，明確組織細胞中HPV的位置及感染的程度。但是，由于本次研究中HPV原位雜交法組納入的樣本量較少，故未能準確地反映出HPV原位雜交法檢測HPV-DNA的效果。實時熒光定量PCR技術主要是利用DNA變性與復性原理，對宮頸脫落細胞進行特定的DNA片段高效擴增，特異性引物及探針分別與靶序列相結合，Taq酶在引物的引導下復制靶序列，遇到結合2條引物之間的探針時發揮“5”游離端外切酶的功能，使探針水解形成游離羧基熒光素發射熒光，合成HNA鏈發射的熒光信號量的增加與序列指數的增長呈正相關。但是，使用實時熒光定量PCR法檢測HPV-DNA時，不僅需要使用專用的實驗室，而且對檢測人員的技術要求較高，不適于作為普查HPV感染的檢測方法[6]。上述研究結果說明，與使用HPV原位雜交法和實時熒光定量PCR法相比，使用DH3法進行HPV-DNA檢測具有操作簡便、無需PCR實驗室、對操作人員無特殊資質要求、價格低廉等特點，適合在各醫療機構中推廣應用。

綜上所述，使用DH3 HPV-DNA檢測法、HPV原位雜交 HPV-DNA檢測法和實時熒光定量PCR HPV-DNA檢測法篩查高危型HPV感染均具有較高的應用效果。與應用HPV原位雜交 HPV-DNA檢測法和實時熒光定量PCR HPV-DNA檢測法相比，用DH3 HPV-DNA檢測法篩查高危型HPV感染更為簡單、方便、快捷，更適用于對HPV感染進行大范圍的篩查。