轉HSSP基因大豆的分子檢測和遺傳穩定性分析

郭丹丹，周靜文，劉 洋，馬曉飛，王思楠，樊 榮，柏 錫

(東北農業大學 生命科學學院， 哈爾濱 150030)

大豆(Glycinemax)富含蛋白質和脂肪，是重要的糧食和油料作物。全世界約75%的大豆主要用于動物飼料[1]，是人類和動物主要的蛋白質來源。大豆氨基酸組成中含硫氨基酸(蛋氨酸、半胱氨酸)相對不足，不利于單胃動物的生長和發育[2]。同時還可能降低動物對疾病的抵抗力。有研究表明，含硫氨基酸缺乏可能阻礙兒童的身心發育[3-4]。

富含硫的異源種子貯藏蛋白在轉基因大豆中的表達可以改善大豆營養品質[5]。Kim等[6]將種子特異性菜豆β-菜豆蛋白啟動子驅動的18 kD玉米醇溶蛋白基因轉入大豆中，使大豆種子中蛋氨酸和半胱氨酸含量增加12%～20%。Li等[7]將27 kD γ-玉米醇溶蛋白基因導入大豆，使種子中的半胱氨酸含量從26.97%增加到29.33%，蛋氨酸含量從15.49%增加到18.57%。另外，將CGS基因轉入擬南芥，使得種子游離蛋氨酸含量增加8～20倍[8-9]。10 kD玉米醇溶蛋白富含含硫氨基酸，將其轉入枯草芽胞桿菌益生菌中，能使菌體蛋氨酸含量提高20.51%[10]。

培育的轉基因作物新品種在商品化之前，對目的基因的整合和表達情況的檢測是必不可少的。外源基因的旁側序列是針對不同轉化事件的唯一性標識，對研究轉基因作物的遺傳穩定性和轉基因作物的產權保護、檢測和監管均具有重要價值[11]。在已知旁側序列位置的基礎上建立事件特異性檢測方法是區分不同轉化事件的高效準確檢測方法。Fan等建立了針對旁側序列和轉基因的事件特異性方法，用于鑒定一個特定的轉基因番木瓜株系。

韓慶梅等[12]研究了高蛋氨酸轉AtD-CGS基因大豆后代植株的遺傳穩定性。胡英迎等[13]對轉精氨酸酶基因玉米進行遺傳特性分析。Liu等[14]研究Bt融合蛋白Cry1Ab/Cry2Aj基因在轉基因玉米事件ZD12-6中可在不同世代下穩定表達。

實驗室前期將10 kD玉米醇溶蛋白進行密碼子改造，并融合大豆球蛋白2基因啟動子，篩選標記基因為Bar，采用農桿菌介導法轉入到受體品種‘東農50’中，獲得大量轉基因材料。本研究以篩選得到的單拷貝轉基因材料GSDH5為試材，基于目的基因的旁側序列確定其插入位置，并在基因水平、轉錄水平、翻譯水平和性狀表現等方面評價轉基因大豆材料的遺傳穩定性和性狀表現，建立GSDH5的特異性檢測方法，為培育高含硫氨基酸轉基因大豆新品種奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

轉基因大豆材料GSDH5由本實驗室擴繁保存，受體品種‘東農50’由東北農業大學大豆研究所提供。

1.2 實驗方法

田間試驗分別于2018-2019年在東北農業大學轉基因試驗基地進行。對T3、T4代GSDH5及‘東農50’采取正常密度人工點播，行距0.5 m，行長18 m，每4壟為一個小區，轉基因田間栽培管理按照《農業轉基因生物安全評價管理辦法》的要求進行。

1.2.1 PCR檢測提取基因組DNA參考黃宣等[16]優化的CTAB法，根據HSSP基因序列設計正反向引物(5′-CAGGGTCTCGCTTCAC-3′和5′-GTCATAGCCATAGGGTTG-3′)，Bar基因序列設計正反向引物(5′-TGCCAGTTCCCGTGCTTGAA-3′和5′-CTGCACCATCGTCAACCACTA-3′)進行基因組DNA分子檢測。反應條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30 個循環；72 ℃延伸10 min。

1.2.2 Southern blot分析使用DIG DNA Labeling and Detection Kit (Roche)試劑盒，按照試劑盒說明書進行，驗證目的基因HSSP在轉基因植株基因組中的整合情況。

1.2.3 RT-PCR檢測采用康為世紀RNA提取試劑盒提取大豆的總RNA(方法參照說明書進行)，反轉錄采用反轉錄試劑盒進行，HSSP基因引物同1.2.1，GmTUA5為內參基因，引物序列(5′- ACCACCAGGAACAACAGAAGG-3′和5′-TGCCACCATCAAGACTAAGAGG-3′)，反應條件同1.2.1。

1.2.4 Real-time PCR檢測按照TransStart Top Green qPCR Super Mix Kit(全式金生物)試劑盒說明書進行，HSSP基因引物同1.2.1，內參基因引物同1.2.3，反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，40 個循環；95 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s。以2-ΔΔCT算法計算HSSP基因的相對表達量。

1.2.5 基因組插入位點分析使用限制性內切酶DraⅠ對基因組DNA進行完全酶切，連接Adpator接頭，建立基因組DNA文庫。以AP1/L1405為引物(GTAATACGACTCACTATAGGGC和CTGCACCATCGTCAACCACTACAT)，進行文庫第一輪擴增。以第一輪PCR擴增產物為模板，AP2/L997為引物(ACTATAGGGCACGCGTGGTC和CTGGCATGACGTGGGTTTCT)，進行第二輪擴增，直到得到單一條帶，測序結果在NCBI網站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上進行Blast比對。反應條件：94 ℃ 25 s，72 ℃ 3 min，7 個循環；94 ℃ 25 s，67 ℃ 3 min，32 個循環；67 ℃ 7 min。

根據測序獲得的旁側序列，在大豆基因組和外源T-DNA插入位點之間設計特異性檢測引物GSDH5-F(TCGTTTCCCGCCTTCAGTTT)和GSDH5-R(GACAGCACAAAGAACGCAGC)，在插入T-DNA區前的大豆基因組序列上設計‘東農50’對照檢測引物DN50-F(AGCACTGACCGACCAAATGT)和DN50-R(AACTGACTAACCCTTCCGCA)，對GSDH5轉化事件、其他轉化事件及非轉化事件進行PCR擴增。 反應條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環；72 ℃延伸10 min。

1.2.6 Western blot檢測大豆籽粒研磨成粉末取0.1 g于2 mL EP管中，加入60%乙二醇，震蕩混勻5 min，水浴鍋50 ℃孵育1 h提取種子醇溶蛋白，6 000 r/min離心10 min，取上清液加入SDS上樣緩沖液，煮沸變性5 min。取上清液15 μL于15% SDS-PAGE進行電泳，轉至PVDF膜，進行Western blot檢測，一抗為HSSP抗血清(1∶500)，二抗為山羊抗兔IgG/HRP(1∶2000)，滴加ECL化學發光液，化學發光儀顯影0.1～10 s，拍照。

1.2.7 粗蛋白含量測定大豆籽粒粉碎后，委托中國農業科學院飼料研究所測定粗蛋白含量。

1.2.8 含硫氨基酸含量測定大豆籽粒粉碎后，委托中國農業科學院飼料研究所測定含硫氨基酸含量，根據公式計算占種子干樣及蛋白的比例。蛋氨酸/胱氨酸占種子干樣/蛋白計算公式：

粗蛋白在干樣中含量(Z)：Z=Y/(1-X/100)

蛋氨酸/胱氨酸占干樣比例(B)：B=A/(1-X/100)

蛋氨酸/胱氨酸占蛋白比例(C)：C=B/(Z/100)

其中，A為蛋氨酸/胱氨酸占鮮樣比例， Y為粗蛋白含量， X為含水量。

1.2.9 農藝性狀調查大豆成熟、收獲后對轉基因株系GSDH5和受體品種‘東農50’進行考種，調查主要的農藝性狀。

1.3 數據分析

采用 Origin 2018軟件進行數據的處理與分析。

2 結果與分析

2.1 轉基因大豆GSDH5的分子檢測

2.1.1 PCR檢測對T1代的GSDH5株系及受體品種‘東農50’涂抹靶標除草劑草銨膦進行初步抗性篩選，對篩選后呈陽性的轉基因大豆株系及受體品種‘東農50’提取DNA進行PCR檢測，陽性對照及轉基因大豆均可擴增出263 bp的目的基因部分片段(圖1，A)和414 bp的標記基因部分片段(圖1，B)，受體品種‘東農50’未能擴增出任何條帶。結果表明，外源基因HSSP和篩選標記基因Bar成功整合到大豆基因組中。

A、B.T1代植株DNA檢測(M.DL2000)：+.陽性質粒；—.東農50；A.HSSP基因檢測(1-8.轉基因植株)； B.Bar基因檢測(1-10.轉基因植株)；C、D.T1代植株Southern blot檢測(M′.DL15000)；C：1-2.東農50；3.Xba Ⅰ酶切產物； 4.Hind Ⅲ 酶切產物；D：1.Xba Ⅰ酶切產物；2.Hind Ⅲ 酶切產物；3.東農50；E.轉基因大豆GSDH5的T-DNA區圖譜圖1 轉HSSP基因材料的分子檢測A and B. DNA detection of T1 generation plants (M. DL2000): +. Positive plasmid; —. Dongnong 50; A. HSSP gene detection: (1-8. Transgenic plants); B. Bar gene detection (1-10 transgenic plants); C and D. Southern blot detection of T1 generation plants (M′. DL15000). C: 1-2. Dongnong 50; 3. Xba Ⅰ digestion product; 4. Hind Ⅲ digestion product. D: 1.Xba Ⅰ digestion product; 2. Hind Ⅲ digestion product; 3. Dongnong 50. E. T-DNA map of transgenic soybean GSDH5Fig.1 Molecular detection of transgenic HSSP materials

RT.根；SM.莖；LF.葉；FR.花；SD.種子。不同小寫字母表示 基因表達量在不同組織中有顯著差異(P<0.05)圖2 HSSP基因在轉基因大豆不同組織中的表達量RT. Root; SM. Stem; LF. Leaf; FR. Flower; SD. Seed. Different normal letters indicate that there are significant differences of gene expression levels among different tissues (P< 0.05)Fig.2 Expression of HSSP gene in different tissues of transgenic soybean

2.1.2 Southern blot檢測為了進一步證明外源基因在大豆中的整合情況，確定外源基因的拷貝數，根據轉基因大豆GSDH5的T-DNA區圖譜(圖1，E)，選取HindⅢ和XbaⅠ兩種限制性內切酶，Bar基因和HSSP基因兩種探針，進行Southern blot檢測。結果顯示，經過酶切的轉基因大豆基因組DNA和陽性對照與Bar基因探針/HSSP基因探針雜交后均出現了單一條帶，而受體品種‘東農50’無雜交條帶形成(圖1，C、D)。證明外源基因HSSP以單拷貝的形式整合到大豆基因組中。

2.1.3HSSP基因種子特異性表達分析提取轉基因大豆不同組織部位根、莖、葉、花、種子的RNA，利用Real-time PCR檢測外源基因HSSP的表達量，結果(圖2)表明，在種子中HSSP基因表達量顯著高于根、莖、葉、花，證明外源基因HSSP在轉基因大豆種子中特異性表達。

2.1.4HSSP基因插入位點分析提取GSDH5的基因組DNA，用DraⅠ進行完全酶切，連接Adpator構建GSDH5基因組DNA文庫。以AP1/L1405 為引物，進行文庫第一輪擴增(圖3，A)。以第一輪PCR擴增產物為模板，AP2/L997為引物，進行第二輪擴增，得到大約963 bp單一條帶(圖3，B)。第二輪PCR產物回收進行測序。將載體序列去掉后，結果提交NCBI數據庫，在GlycinemaxWm82.a2.v1 基因組數據中進行BLASTN搜索(圖3，C)。結果表明，該序列與1號染色體52 873 248～52 873 883 bp匹配，并且落到了非編碼區域，確定了T-DNA區插入到大豆1號染色體基因組的52 873 883 bp處。

2.2 轉基因大豆GSDH5遺傳穩定性分析

2.2.1 特異性PCR檢測特異性引物設計在轉基因大豆GSDH5的外源T-DNA序列和大豆基因組之間，其他轉基因材料和受體‘東農50’不會擴增出特異性條帶，只有GSDH5能擴增出預期大小約395 bp的片段。而對照引物設計在插入T-DNA區前的大豆基因組序列上，僅有受體‘東農50’能擴增出728 bp的片段，轉基因材料無法擴增出產物。證明引物對GSDH5-F/GSDH5-R可以特異性識別轉基因大豆GSDH5(圖4，A)。

2.2.2 RT-PCR檢測采用RT-PCR檢測T2、T3和T4代轉基因大豆中外源基因HSSP和內參基因TUA5的表達量。結果(圖4，B)顯示，在大豆籽粒中，外源基因HSSP在轉錄水平上穩定表達，且在T2、T3和T4穩定遺傳。

2.2.3 Western blot檢測為檢測外源基因在翻譯水平上的表達情況，從T3、T4代轉基因大豆GSDH5的成熟籽粒中提取蛋白進行Western blot檢測(圖4，C)，GSDH5在10 kD左右出現雜交條帶，而非轉基因大豆沒有出現雜交條帶，表明外源基因HSSP在翻譯水平上穩定表達。

綜合上述結果表明，外源基因HSSP在轉基因大豆中穩定表達，并且在T2、T3和T4中穩定遺傳。

2.3 轉基因大豆GSDH5性狀表現

2.3.1 轉基因株系GSDH5的粗蛋白含量測定T3、T4代轉基因大豆GSDH5和受體品種‘東農50’的粗蛋白含量。結果(表1)顯示。在T3代中，測得‘東農50’粗蛋白含量為43.32%，GSDH5粗蛋白含量為43.03%，變幅0.6%。T4代中，‘東農50’粗蛋白含量為41.53%，GSDH5粗蛋白含量為40.18%，變幅3%。由于不同植株間粗蛋白含量不同，而蛋白積累也和當年的栽培條件、環境條件直接相關。本研究中粗蛋白含量并沒有極大改變，沒有達到影響其品質的結果，而對于這一性狀的微量改變原因，也需要對其后代進行重復試驗驗證。

A、B.GSDH5基因組文庫巢式PCR結果。M. DL2000；A.一輪PCR，引物對AP1/L1405；B. 二輪PCR， 引物對AP2/L997；C. 測序結果Blast 分析圖3 HSSP基因插入大豆基因組旁側序列分析A and B. Nested PCR results of GSDH5 genome library. M.DL2000; A. The first round of PCR, primer pair AP1/L1405; B. The second round of PCR, primer pair AP2/L997; C. Blast analysis of sequencing resultsFig.3 Analysis of the flanking sequence of HSSP gene inserted into soybean genome

2.3.2 轉基因株系GSDH5的含硫氨基酸含量測定T4代轉基因大豆GSDH5和受體品種‘東農50’的含硫氨基酸(蛋氨酸、胱氨酸)占種子干樣/蛋白的比例。結果(表2)顯示，轉基因大豆GSDH5中胱氨酸占種子干樣的比例為0.65%，甲硫氨酸占種子干樣的比例為0.70%，與受體品種‘東農50’相比占比顯著升高，其中胱氨酸增長了5%，甲硫氨酸增長了9%。胱氨酸占種子蛋白的比例為1.52%，甲硫氨酸占種子蛋白的比例為1.62%，與受體品種‘東農50’相比顯著升高，其中胱氨酸增長了10%，蛋氨酸增長了25%。證明HSSP基因的導入增加了大豆中含硫氨基酸的含量。

2.3.3 主要農藝性狀分析為了分析外源基因HSSP的導入是否會影響轉基因大豆的株高、產量等性狀，調查了T3、T4代轉基因大豆GSDH5及受體品種‘東農50’的主要農藝性狀。結果(表3)顯示，轉基因大豆的結莢習性為亞有限性，花色為白色，葉形為長葉，與受體品種‘東農50’表現一致。轉基因大豆的生育期在121～125 d，株高略低于受體品種，而單株莢數高于受體品種，分枝數和百粒重均與受體品種相近。雖然在株高、單株莢數方面與受體品種略有差異，但都不存在顯著性。說明外源基因的導入對大豆植株的生長發育無不良影響。

表1 GSDH5株系粗蛋白含量

A.T2、T3、T4代植株特異性PCR檢測：M. DL2000；WT.東農50/其他轉基因事件；1.轉基因植株；2.東農50； B.T2、T3、T4代植株RT-PCR檢測：WT.東農50；C. T3、T4代植株Western blot檢測圖4 轉HSSP基因材料遺傳穩定性檢測A. Detection of plant specific PCR in T2, T3 and T4 generations: M. DL2000; WT. Dongnong 50/other transgenic events; 1. Transgenic plants; 2. Dongnong50; B. Detection of RT-PCR in T2, T3 and T4 generations: WT. Dongnong 50; C. Western blot detection of T3 and T4 generation plantsFig.4 Genetic stability test of HSSP transgenic materials

表2 GSDH5株系含硫氨基酸含量

表3 不同世代轉基因株系GSDH5農藝性狀調查結果

3 討 論

商業化的植物轉化體均具有良好的遺傳穩定性的生物學特征。目前，已商業化的轉基因植物一般具有抗蟲、抗病的特性[17-18]。而對于提高含硫氨基酸的這種營養型轉基因大豆多數研究僅停留在得到轉基因植株，對其產業化應用價值未見報道。本研究以轉HSSP基因大豆GSDH5為材料，測得轉基因株系中含硫氨基酸占種子干樣/蛋白的比例均顯著升高，證明了通過異源表達高含硫氨基酸貯藏蛋白基因來提高大豆中含硫氨基酸含量是可行的。

外源基因整合在受體基因組中的位置、拷貝數是影響外源基因穩定遺傳和表達的重要因素，在不同世代中，外源基因的遺傳和表達的變化將影響轉基因植株的使用價值[19]。韓慶梅等[12]對兩個世代的高蛋氨酸轉基因大豆的目的基因整合情況進行分析，證明AtD-CGS基因可在不同的遺傳背景下穩定遺傳與表達。張立堅等[20]研究了TaNAC14轉基因小麥的遺傳穩定性。本研究對轉基因株系GSDH5進行PCR、Southern blot檢測，證明外源基因是以單拷貝的形式成功整合到受體品種大豆基因組中。通過旁側序列的分析，建立了轉基因大豆GSDH5特異性檢測方法。轉化體特異性PCR不僅簡單快捷，而且具有針對性，常用于鑒定外源基因在轉基因株系后代中的遺傳穩定性。RT-PCR和Western blot檢測結果表明，外源基因在轉錄和翻譯水平上穩定遺傳和表達。在育種方面改變自然規律而產生毒害作用的報道出現很多，例如在提高含硫氨基酸含量后導致大豆品系產量低、品質性狀下降的現象[21-22]。本研究中轉基因大豆在含硫氨基酸提高的基礎上，蛋白含量與受體品種相比有所下降，但是變化極小，沒有達到影響其品質的結果。Hari B. Krishnan等[23]研究表明，使OASS過表達能夠增加含硫氨基酸含量，但是會對植物生長產生負面影響。本研究對植物的農藝性狀進行調查分析，在單株莢數、百粒重、株高、結莢習性、花色、葉形等方面均未發生較大改變，證明HSSP基因的插入沒有導致不良性狀出現。本研究對生產具有高甲硫氨酸含量并對其種子活力，植物生長和生產力造成最小干擾的轉基因種子提供理論依據，為營養型轉基因大豆產業的發展提供了基礎材料。