小麥MBD基因家族的鑒定和特征分析

張新寧，邢真真，李 靜，范姍姍，孟凡榮*

(1 河南農業大學 生命科學學院，鄭州 450002；2 河南農業大學 農學院，鄭州 450046)

DNA甲基化是植物表觀遺傳修飾的主要形式之一，在轉座子沉默、維持基因組穩定性、基因表達調控及基因組印記等過程中發揮重要功能[1]。研究發現，甲基結合蛋白(methyl-binding domain protein，MBD)能夠特異識別并結合DNA甲基化位點，參與了核小體重塑因子和組蛋白去乙酰化酶的招募及轉錄抑制復合體的形成過程，通過表觀修飾調控基因表達[2-3]。MBD蛋白中與甲基化DNA特異結合的最小區域為85個氨基酸，該區域能夠形成由β折疊和α螺旋等組成的特殊楔形結構，其中位于β折疊區的Val、Arg、Tyr和Ser殘基是識別甲基化DNA關鍵位點[4]。近年來，關于植物MBD蛋白的功能有了新的發現，例如擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)的AtMBD6蛋白參與了RNA介導的基因沉默[5]，AtMBD7蛋白特異識別甲基化DNA位點，AtMBD9蛋白通過特異識別組蛋白乙酰化位點與AtMBD7蛋白共同參與了植物主動去甲基化的分子調控過程[6-7]。

植物MBD基因家族包含多個家族成員，已從擬南芥、水稻(OryzasativaL.)和玉米(ZeamaysL.)中分別鑒定到13、17和14個MBD基因[8]。根據氨基酸的相似性可以將擬南芥MBD蛋白分為8個亞類，其中第Ⅳ和Ⅵ亞類為雙子葉植物所特有，水稻和玉米的MBD蛋白分屬于其余6個亞類[9]。研究發現，MBD基因在植物生長發育過程中發揮著重要調控功能。例如，擬南芥的AtMBD8參與了開花基因FT和SOC1的表達調控[10]，AtMBD9與開花抑制因子FLC的表達調控密切相關[11-12]，AtMBD11的表達抑制也導致了擬南芥的育性下降和發育異常現象[13]。對玉米中MBD蛋白的研究發現，ZmMBD101蛋白通過與甲基化DNA的結合參與了組蛋白修飾調控及轉座子沉默過程[14]，而且一些ZmMBD基因受干旱和鹽脅迫的誘導而呈現特定的響應模式[15]。在水稻中發現，OsMBD707基因過表達后水稻分蘗角度變大，而且影響到了FT開花調控途徑中相關基因的表達，進而導致轉基因水稻對光周期的敏感性顯著降低[16]。

課題組前期研究中，分離鑒定了小麥(TriticumaestivumL.)的6個TaMBD基因，并初步分析了其時空表達特性[17]；其中，TaMBD1、TaMBD4和TaMBD5在成熟種子和萌發過程的胚乳中具有較高的表達水平，在干旱脅迫條件下TaMBD5和TaMBD6呈上調表達趨勢。本研究中，通過對小麥全基因組比對系統分析了小麥MBD家族成員的組成、染色體分布、序列特征和表達模式，為進一步探討小麥MBD基因的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

本實驗所用小麥品種為‘中國春’，分別對萌發48 h的胚和胚乳、一葉一心期的根和葉、五葉期的莖、幼穗和成熟種子進行取樣，用于TaMBD6和TaMBD9基因的表達模式分析。所有樣品取樣后放入液氮速凍后于-80 ℃保存。

1.2 方 法

1.2.1 小麥MBD基因家族成員的鑒定利用Pfam數據庫(http://pfam.xfam.org)中的MBD保守域氨基酸序列(PF01429)進行小麥基因組數據庫比對(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Tools/Blast)，獲得候選小麥MBD基因序列。同時，將已報道擬南芥、玉米和水稻的MBD蛋白序列進行小麥基因組數據庫比對(網址同上)，獲得小麥候選MBD基因序列。將上述所有小麥候選MBD基因序列進行本地比對，并利用NCBI的 CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)進行MBD保守域的注釋，最終確定小麥MBD基因家族成員，小麥MBD基因的染色體定位使用MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1)繪制。

1.2.2 小麥MBD蛋白的比對和聚類分析依據擬南芥MBD蛋白家族成員分類標準，同時參考玉米和水稻MBD蛋白的分布特性[9]對小麥的MBD蛋白成員進行亞類的劃分；聚類分析通過MEGA6軟件的NJ法進行，蛋白質的理化特性采用DNAMAN軟件進行分析；利用Cluster X軟件分析小麥MBD結構域的保守氨基酸位點，并使用Genedoc軟件作圖。

1.2.3 小麥MBD家族成員的基因組結構分析從Ensemble Plant(http://plants.ensembl. org/index.html)下載小麥MBD基因家族的DNA序列和CDS序列，使用GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)繪制基因結構圖。

1.2.4 小麥MBD基因啟動子序列特征分析利用小麥MBD基因起始密碼子上游2 000 bp的序列，通過PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) 進行轉錄調控元件的預測分析，并利用TBtools軟件進行繪圖。

1.2.5 小麥MBD基因的表達模式分析利用WheatEXP(http://wheat.pw.usda.gov/WheatExp)轉錄組數據進行小麥MBD基因表達模式的分析。其中包括根、莖、葉、穗和種子的組織表達數據，脅迫數據來自于干旱脅迫處理后1 和6 h的小麥葉片，熱脅迫處理1 和6 h的小麥葉片以及干旱和熱脅迫同時處理1 和6 h后的葉片。熱脅迫溫度為40 ℃，干旱脅迫采用20% PEG溶液，表達模式分析采用HemI軟件繪制熱圖。

實時定量表達分析的總RNA提取使用TransGen公司TransZol Plant試劑盒，cDNA反轉錄采用TaKaRa公司PrimeScript RT Reagent Kit試劑盒，均按照說明書進行實驗操作。實時定量PCR所用特異引物序列詳見表1，實時定量qRT-PCR采用20 μL反應體系，其中包括2×SYBR GreenⅡ 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，40個循環；以小麥β-Actin為內參基因，設置3個重復，相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算。

2 結果與分析

2.1 小麥MBD基因家族成員的鑒定

通過對小麥全基因組分析，共鑒定到16個小麥MBD基因家族成員，其中包含44個基因位點(表2)。對小麥MBD蛋白理化特性分析顯示，小麥MBD的氨基酸長度在家族成員間差異較大，最小的蛋白僅119個氨基酸(13.4 kD)，而最大的蛋白包含2 092個氨基酸(231.8 kD)；理論等電點的范圍在4.12～9.77之間。對小麥MBD基因家族成員的染色體定位分析發現，MBD基因成員在基因組中的分布較為分散，主要集中在第1、2、5、6和7號染色體群上，其中第7號染色體群上的MBD基因位點最多，為16個(圖1)。

2.2 小麥MBD蛋白的分類

利用擬南芥、玉米、水稻和小麥的MBD蛋白(分別為13、10、12和44個)進行聚類分析顯示，擬南芥MBD家族成員共分為8個亞類(Ⅰ～Ⅷ)，禾本科作物的MBD蛋白分布在除第Ⅳ亞類(以AtMBD5和AtMBD6為代表)和第Ⅵ亞類(以AtMBD7為代表)外的其余6個亞類中(圖2)，小麥MBD成員最多是第Ⅷ亞類，包括5個小麥MBD成員(TaMBD3、TaMBD7、TaMBD13、TaMBD15和TaMBD16)、7個水稻MBD(OsMBD705、OsMBD712、OsMBD713、OsMBD714、OsMBD716、OsMBD717、OsMBD718)和2個玉米MBD(ZmMBD113和ZmMBD114)。其次是第Ⅲ亞類，包括3個小麥MBD(TaMBD2、TaMBD10和TaMBD14)；第Ⅱ亞類中，包含了3個小麥MBD(TaMBD1、TaMBD4和TaMBD5)；小麥TaMBD6和TaMBD11與水稻OsMBD707屬于第Ⅰ亞類，其中TaMBD6與水稻OsMBD707同源性最高；TaMBD8和TaMBD12屬于第Ⅶ亞類；第Ⅴ亞類成員最少，僅包括小麥的 TaMBD9和玉米的ZmMBD116。小麥MBD家族成員較多，而且多數成員具有3個分別位于A、B和D基因組的同源基因，推測這些成員間存在一定的功能冗余現象。

表1 實時定量PCR引物

表2 小麥MBD基因家族成員信息

圖1 小麥MBD基因的染色體定位Fig.1 Chromosome location of wheat MBD genes

結構域分析顯示(圖3)，第Ⅰ亞類成員含有與轉錄調控相關的結構域PRK05901，第Ⅱ和Ⅲ亞類成員含有結合DNA和促進蛋白互作的Zf-CW結構域[18]。第Ⅴ亞類成員含有PHD、FYRN、Bromodomain、PHD1_ Lid2p_like、WHIM1和WSD結構域，其中PHD參與了染色質介導的轉錄調控[19]，Bro結構域能夠識別組蛋白的乙酰化修飾[20]，PHD1_Lid2p_like結構域與組蛋白H3K4和H3K9的甲基化修飾具有互作功能[21]，WHIM1和WSD結構域在調控兩個相鄰核小體的間距方面發揮功能[22-23]，這預示著該亞類MBD在依賴于表觀遺傳的基因表達調控過程中發揮重要功能。第Ⅷ類MBD成員中，含有TAF12保守域，該結構域可以與TATA結合蛋白互作參與轉錄復合物的形成和基因表達調控過程[24]。

對小麥MBD蛋白保守結構域內甲基化DNA結合位點分析發現(圖4)，第Ⅰ亞類MBD成員中具有4個與甲基化DNA結合的關鍵氨基酸位點，第Ⅱ、Ⅲ和Ⅷ亞類成員中均含有5個，其中，Ⅷ亞類包含2個MBD保守域的TaMBD13、TaMBD15和TaMBD16，其1個MBD結構域的與甲基化DNA結合的關鍵氨基酸殘基全部缺失；第Ⅴ和Ⅶ亞類成員缺失了3個。

2.3 TaMBDs的基因組結構分析

對小麥MBD基因家族成員的基因組結構分析顯示(圖5)，同一亞類內MBD基因家族成員間具有相似的基因組結構，而不同亞類間的基因組結構差異較大。第Ⅰ(TaMBD6和TaMBD11)和Ⅱ(TaMBD1、TaMBD4和TaMBD5)亞類MBD基因家族成員的內含子數量較少(1～3個)，且具有相似的基因組結構。第Ⅲ(TaMBD2、TaMBD10和TaMBD14)和Ⅶ(TaMBD8和TaMBD12)亞類的內含子數在3～5個之間，第Ⅷ(TaMBD3、TaMBD7、TaMBD13、TaMBD15和TaMBD16)亞類成員的內含子數在4～9個之間；而TaMBD9含有10個內含子，且內含子均較長，特別是第一內含子達到10 000 bp以上。

2.4 TaMBD基因啟動子的順式作用元件分析

對小麥MBD基因啟動子區域的序列分析發現，除了轉錄調控元件TATA-box和CAAT-box外，還發現了4種植物激素響應元件，包括茉莉酸甲酯(MeJA)、脫落酸(abscisic acid)、生長素(auxin)和赤霉素(gibberellin)的響應元件；另外，一些與環境響應相關的轉錄調控元件也包含其中，例如一些與光響應(light responsive)、缺氧脅迫響應(anaerobic induction/GC-motif)、干旱脅迫響應(drought-inducibility)、鹽脅迫響應(salt stresses)和低溫脅迫響應(low-temperature responsive)相關的調控元件等(圖6)。小麥MBD基因啟動子區域普遍含有光響應元件和ABA響應元件。第Ⅰ亞類成員都含有生長素響應元件和干旱脅迫響應元件。第Ⅲ和第Ⅶ亞類成員包含有赤霉素響應元件，在TaMBD8-B和TaMBD12-D的啟動子區還發現了鹽脅迫響應元件。在TaMBD9-B/D的轉錄調控區包含有干旱脅迫響應元件，TaMBD9-D中還有低溫響應元件，TaMBD9-A的啟動子區還檢測到水楊酸響應元件，推測該基因的3個部分同源基因間在轉錄調控水平存在一定的差異，預示著它們在環境脅迫響應過程中發揮不同的調控功能。

擬南芥、小麥、玉米和水稻MBD蛋白成員分別用AtMBDs、 TaMBDs、ZmMBDs和OsMBDs表示圖2 小麥MBD蛋白的系統發育分析Arabidopsis, wheat, maize and rice MBD protein members are represented by AtMBDs, TaMBDs, ZmMBDs and OsMBDs, respectivelyFig.2 Phylogenetic analysis of wheat MBD proteins

2.5 小麥MBD基因的表達特性分析

對小麥MBD基因的組織表達特性分析顯示(圖7，A)，在穗和籽粒中MBD基因家族的整體表達水平較高，分別有40和22個基因位點在這2個組織中高表達，在穗發育的早期(spike_z32)，除了TaMBD1-1A/1D、TaMBD4-1A/1D、TaMBD5-1D、TaMBD10-7B、TaMBD15-7B/7D和TaMBD16-7D之外，其余31個MBD基因位點的表達量均比其他組織高，表明MBD家族的不同成員在小麥穗發育的早期發揮重要功能；在種子發育過程中，TaMBD9-6A/6B/6D、TaMBD14-7D、TaMBD15-7B/7D和TaMBD16-7D這7個基因位點在花后2 d籽粒中(grain_z71)表達量最高，之后呈下調表達趨勢；TaMBD1-1A/1B/1D、TaMBD2-5A/5B/5D、TaMBD4-1A/1B/1D、TaMBD5-1D、TaMBD7-7A/7D、TaMBD8-5A/5B/5D、TaMBD11-5B、TaMBD12-7A/7B/7D共19個基因位點在花后30 d籽粒中(grain_z85)表達量最高；表明不同MBD家族成員在種子發育過程中可能發揮不同的調控功能；在葉片和根中，除了TaMBD10-7B和TaMBD13-2A外，其他MBD家族成員表達量均很低。在小麥苗期莖中部分MBD基因位點有表達，但隨著發育進程，到開花期的莖中(stem_z65)，除了TaMBD3-2A/2B外，其余家族成員表達量很低。這表明不同MBD家族成員在小麥生長發育的不同時期、不同組織發揮著調控功能。

圖3 小麥MBD蛋白的結構域分析Fig.3 Domain analysis of wheat MBD proteins

α、β、L分別代表MBD保守域的二級結構α螺旋、β轉角、Loop結構；※表示與甲基化DNA結合的關鍵氨基酸殘基圖4 小麥MBD結構域的保守位點分析α, β, and L represent the secondary structure of α helix, β turn, and Loop structure, respectively; The key amino acid residues that bind to methylated DNA are indicated by ※Fig.4 Analysis of conserved sites of wheat MBD domains

對干旱及熱脅迫后MBD家族基因的表達結果分析顯示(圖7，B)，干旱脅迫后TaMBD1-1B、TaMBD3-2A/2B/2D、TaMBD4-1B、TaMBD6-5B、TaMBD7-7A/7D、TaMBD9-6A/6D、TaMBD13-2B/2D共12個位點在干旱脅迫6 h上調表達；TaMBD1-1D、TaMBD4-1D、TaMBD5-1D這3個位點在干旱脅迫后下調表達；在熱脅迫條件下，大多數MBD成員在熱脅迫6 h上調表達，而TaMBD3-2A/2B/2D、TaMBD9-6A/6B/6D、TaMBD11-5B、TaMBD13-2A/2B/2D共10個位點是熱脅迫后下調表達，部分MBD家族成員(如TaMBD9-6A/6D、TaMBD13-2B/2D等)在干旱脅迫和熱脅迫條件下模式完全相反；表達模式分析顯示，小麥MBD基因在干旱和高溫雙重脅迫下的響應模式和單獨熱脅迫的響應模式更為接近，推測小麥MBD基因對熱脅迫更加敏感。

圖5 小麥MBD基因的基因組結構Fig.5 Genomic structures of wheat MBD genes

z10.一葉期；z13.三葉期；z23.分蘗早期；z30.起身期；z32.拔節早期；z39.拔節晚期；z65.開花中期；z71.花后2 d； z75.花后10 d；z85.花后30 d。顏色代表表達水平的高(紅色)和低(綠色)圖7 小麥MBD基因在不同組織(A)和脅迫(干旱脅迫、熱脅迫和干熱脅迫)下的表達模式(B) z10. One-leaf stage; z13. Three-leaf stage; z23. Early tiller stage; z30. Rise stage; z32. Early jointing stage; z39. Late jointing stage; z65. Mid-flowering; z71. 2 days after flowering; z75. 10 days after flowering; z85. 30 days after flower. The color represents the high (red) and low (green) expression levelsFig.7 The expression patterns of wheat MBD genes in different tissues (A) and stress including drought stress, heat stress and dry heat stress (B)

圖8 TaMBD6和TaMBD9的ABD部分同源基因的組織表達分析Fig.8 Tissue expression analysis of ABD homologous genes of TaMBD6 and TaMBD9 genes

研究發現，擬南芥AtMBD9基因與開花調控和分支發育調控密切相關[11]，而水稻OsMBD707基因也在發育調控過程中發揮重要功能，該基因過表達后轉基因水稻的分蘗角變大[16]。對小麥MBD蛋白成員的聚類分析顯示，TaMBD6和TaMBD9分別與水稻的OsMBD707和擬南芥的AtMBD9蛋白質序列高度相似，因此將這2個小麥的MBD基因作為后續研究的重點。對TaMBD6和TaMBD9兩個基因的組織表達特性分析結果(圖8)顯示，TaMBD6和TaMBD9的3個部分同源基因不同組織間存在表達差異，但均在幼穗中表達量最高，除了幼穗的高表達外，TaMBD6-A在根和葉中的表達次之，而在萌發過程的胚乳中表達水平最低；TaMBD6-B則在莖中的表達水平高于根、葉和萌發過程的胚，在種子和萌發過程中的胚乳中表達很低；TaMBD6-D的整體表達水平要低于TaMBD6-A和TaMBD6-B，在莖和萌發過程胚中的表達量相對其他組織而言略高。從上述差異表達模式推測，TaMBD6基因可能在小麥組織器官的發育調控過程中發揮功能。對TaMBD9的組織表達特性分析發現，該基因的3個部分同源基因在根、莖和葉中均具有較高的表達水平，推測該基因在營養器官的發育調控過程中發揮功能；在成熟種子及萌發過程的種子中TaMBD9-B的表達水平要低于另外2個來源于A和D基因組的部分同源基因，推測TaMBD9-B在種子中發揮的功能較弱。

3 討 論

植物MBD基因家族成員較多，這預示著該類基因在植物生長發育調控過程中具有重要功能，從聚類分析來看各成員間蛋白序列及保守功能域差異較大，推測各成員間的具體生物學功能也存在一定差異。本研究中，鑒定了小麥的16個MBD基因，由于小麥異源六倍體的基因組特性導致多數基因都存在3個部分同源的基因位點，所以小麥基因組中共檢測到44個MBD基因位點。不過，TaMBD5和TaMBD16僅在D基因組存在單個位點，從序列相似性來看，這兩個位點分別與TaMBD4和TaMBD15高度相似，推測可能是在進化過程中基因的跳躍或片段復制所致[25]。從基因位點的分布特征來看，TaMBD1、TaMBD4和TaMBD5在染色體上呈集中串聯分布，這種染色體上緊密排列形成的基因簇很可能與基因家族成員間功能上的協同密切相關[26]。通過對小麥全基因組鑒定，沒有發現第Ⅳ和Ⅵ亞類的MBD蛋白成員的存在，這與前人關于第Ⅳ和Ⅵ亞類MBD成員為雙子葉植物所特有的結論相一致[27]。在第Ⅲ、Ⅶ和Ⅷ亞類MBD基因中，含有數量較多的內含子，這就增加了轉錄后mRNA加工的復雜性和可變剪切發生的可能性，推測內含子的插入可能促進了小麥MBD基因家族的進化和功能的分化[28-29]。

MBD蛋白是一類能夠特異識別甲基化DNA的調控因子，在基因表達調控及依賴于表觀遺傳學的發育調控過程中發揮重要功能。在鑒定的小麥MBD蛋白家族成員中，均檢測到與甲基化DNA或染色體修飾互作的多個保守結構域，其中第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅷ亞類小麥MBD成員可能參與了依賴于DNA甲基化的基因表達調控，而第Ⅴ亞類MBD成員可能與依賴于組蛋白修飾的基因表達調控有關[14]。目前，已有證據表明植物的MBD蛋白直接參與了發育進程的分子調控過程。例如，擬南芥AtMBD8通過對組蛋白修飾的識別參與了開花基因FT和SOC1的表達調控[10]，AtMBD9參與了依賴于染色質重塑的開花基因FLC的表達調控[11-12]，TaMBD9與擬南芥的AtMBD9高度相似，研究發現擬南芥AtMBD9與開花調控和分支發育調控密切相關，AtMBD9可以通過調節DNA的甲基化和組蛋白的乙酰化等過程參與開花進程的分子調控，小麥TaMBD9與AtMBD9同源性最高，但與其相比，都包含PHD、Bromodomain、PHD1_Lid2p_like等與組蛋白修飾相關的保守域，但又比AtMBD9少了1個MBD保守域，推測其可能在小麥生長發育過程中可以通過組蛋白修飾參與基因表達調控;AtMBD11基因抑制表達后導致種子育性下降和葉片形態異常[13]。OsMBD707過表達后[16]，轉基因水稻的分蘗角度變大，小麥TaMBD6與擬南芥AtMBD11、水稻OsMBD707同屬于一個亞類，可能在小麥中也發揮著相似的功能；另外，研究還發現擬南芥AtMBD4蛋白與磷酸鹽轉運蛋白基因啟動子區域的超甲基化調控相關，進而參與了磷素吸收利用的分子調控過程[30]。本研究中也發現，小麥MBD基因的啟動子區域存在多種與環境響應密切相關的調控元件，比如與光響應、生長素(ABA、茉莉酸甲酯和赤霉素)響應和非生物脅迫響應有關的調控元件等，預示著小麥MBD基因可能與生長發育和非生物脅迫響應相關基因的表達調控有關。干旱和高溫脅迫響應模式分析發現，TaMBD6和TaMBD9在干旱處理或者高溫處理后相對于未處理的表達有差異，推測其可能參與小麥對非生物脅迫的調控過程。同時，受到異源六倍體基因組復雜性的影響，小麥MBD基因家族成員間可能存在功能冗余現象，來源于3個基因組的部分同源基因之間存在時空表達特性的差異，這增加了開展小麥MBD家族成員功能研究的難度[31]。