中國滇芎屬花粉形態及葉表皮微形態特征的研究

許新銳，周頌東，何興金

(四川大學 生命科學學院，生物資源與生態環境教育部重點實驗室，成都 610064)

滇芎屬(PhysospermopsisH.Wolff)是傘形科(Apiaceae)芹亞科(Apioideae)美味芹族(Smyrnieae)中的一個較為原始的屬，多年生草本植物，全世界約有11個種[1-4]。《Flora of China》記錄了8種滇芎屬植物，其中4種為中國特有種[5]。然而多數學者[3, 6-7]已經根據形態和分子證據將楔葉滇芎(PhysospermopsiscuneataH.Wolff)從滇芎屬劃分出去，楔葉滇芎真正的歸屬還需進一步的研究。該屬植物主要分布于喜馬拉雅山脈以及橫斷山脈地區，主要生長于海拔2 250～4 800 m的松林下、高山草甸以及灌叢中[8-12]。滇芎屬是芹亞科中一個分類比較困難的類群，種間界限不清晰，與鄰近屬如瘤果芹屬(TrachydiumLindl.)、棱子芹屬(PleurospermumHoffm.)以及東俄芹屬(TongoloaH.Wolff)的屬間界限也存在很多問題。

到目前為止，國內外學者從分子系統學、果實解剖學及微形態學、孢粉學等方面對該屬植物進行了部分研究[6-7, 13-20]，但是對滇芎屬葉表皮微形態特征研究的報道還未曾有過。在傘形科的形態分類學研究方面，植物葉表皮的形態經常被作為分類依據之一[21-24]。這是由于植物的葉表皮形態較為穩定,氣孔器特征、葉片表面紋飾、細胞垂周壁式樣等特征具有種間差異，研究這些特征具有一定的分類學意義。另外，花粉形態學研究是傘形科植物分類學研究的重要依據，大量研究表明[25-29]，花粉形態、萌發孔類型和外壁紋飾等特性為傘形科植物的分類提供了許多有價值的信息。席以珍等[19]報道了1種滇芎花粉形態，王萍莉等[20]報道了5種滇芎形態，發現滇芎屬的花粉立體形狀為三棱球形，赤道面分為菱形、近菱形、近矩形3種形態，極面為3裂圓形或三角形，萌發孔類型、外壁、紋飾在種間無顯著差異，反映了該屬的自然性。

本研究報道了滇芎屬7種植物的花粉形態以及葉表皮微形態，其中3種的花粉形態為首次報道，7種葉表皮微形態為首次報道。本研究通過掃描電子顯微鏡對滇芎屬植物的花粉形態和葉表皮形態進行觀察比較，為滇芎屬的種間關系與屬下系統發育研究提供參考資料。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究的7種滇芎屬物種分別為滇芎[Physospermopsisdelavayi(Franchet) H.Wolff]、全葉滇芎[P.alepidioides(H.Wolff & Handel-Mazzetti) R.H.Shan]、木里滇芎(P.muliensisR.H.Shan & S.L.Liou)、麗江滇芎(P.shanianaC.Y.Wu & F.T.Pu)、紫脈滇芎[P.rubrinervis(Franchet) C.Norman]、波棱滇芎[P.obtusiuscula(Wallich ex de Candolle) C.Norman]、小滇芎[P.kingdon-wardii(H.Wolff) C.Norman]，研究材料為干燥后的葉片和花粉，材料來源見表1，憑證標本保存于四川大學標本館(SZ)，憑證材料保存于四川大學生命科學學院植物系統與分子進化生物學實驗室。

表1 材料來源

1.2 方 法

1.2.2 葉表皮掃描電鏡觀察先將葉片酒精梯度脫水(15%、30%、50%、70%、85%、95%Ⅰ, 95%Ⅱ, 100%Ⅰ, 100%Ⅱ, 每個梯度時間間隔1 min左右)，然后避開明顯的葉脈，剪取葉片近軸面(上表皮)和遠軸面(下表皮)中部的材料，將其粘在導電膠上，噴金鍍膜后，置于JSM-7500F型掃描電鏡下觀察后拍照保存并分析。葉表皮描述的術語參照Baranova[33]和Wilkinson[34]的描述。數據測量工作用軟件KaryoType[30]完成，在遠軸面隨機選取10個氣孔來測量氣孔的大小，取均值作為各物種氣孔的平均大小。

2 結果與分析

2.1 滇芎屬花粉形態特征

本研究報道的滇芎屬植物中，花粉形態分為3種類型，即菱形類型、橢圓形類型和近矩形類型。(1)滇芎、全葉滇芎、麗江滇芎和波棱滇芎的花粉屬于菱形類型，其花粉粒的赤道面觀均為菱形，赤道中心位置向外突出。滇芎的極面觀為三角形，全葉滇芎、麗江滇芎和波棱滇芎的極面觀則均為三角圓形。極軸長19.57～23.19 μm，赤道軸長13.99～17.42 μm，極軸與赤道軸之比P/E為1.22～1.48。(2)紫脈滇芎和小滇芎為橢圓形類型。它們的赤道面觀均為橢圓形，赤道中心位置稍向外突出。紫脈滇芎的極面觀為三角形，小滇芎的極面觀為鈍三角形。(3)木里滇芎為近矩形類型。其赤道面為近矩形，赤道兩側近乎平直，極面觀為鈍三角形。

2.2 滇芎屬葉表皮微形態特征

觀察近軸面的微形態可以發現，滇芎屬植物葉片上表皮的細胞輪廓大都不清晰(圖版Ⅱ，A1、B1、D1、E1、F1、G1)，只有木里滇芎的葉片上表皮細胞為規則的多邊形(圖版Ⅱ，C1)。大部分滇芎屬植物的角質膜紋飾為不規則的條紋(圖版Ⅱ，A1、D1、E1、F1、G1)，滇芎和波棱滇芎還有明顯的脊狀突起，紫脈滇芎和小滇芎具有不太突出的脊狀突起；而全葉滇芎和木里滇芎的角質膜接近光滑，其中也存在少量的條紋，且全葉滇芎的葉片上表皮也可以看到一些不太明顯的脊狀突起(圖版Ⅱ，B1、C1)。

觀察遠軸面的微形態可以發現，除了木里滇芎的葉片上表皮細胞為規則的多邊形(圖版Ⅱ，C2)，滇芎屬其他植物葉片上表皮的細胞輪廓還是大都不清晰(圖版Ⅱ，A2、B2、D2、E2、F2、G2)。滇芎、麗江滇芎、紫脈滇芎、小滇芎的角質膜紋飾為密集的條紋(圖版Ⅱ，A2、D2、E2、G2)，全葉滇芎的較致密具少量條紋及顆粒(圖版Ⅱ，B2)，木里滇芎和波棱滇芎的角質膜接近光滑，且在氣孔器周圍有少量條紋(圖版Ⅱ，C2、F2)。

觀察發現，遠軸面的氣孔數量及密度均大于近軸面。我們對氣孔的觀察和統計均來自遠軸面。滇芎屬植物的氣孔器的形狀均為橢圓形及卵圓形。其中，滇芎、麗江滇芎和小滇芎的氣孔形狀為橢圓形(圖版Ⅱ，A3、D3、G3)，其長寬比L/W為1.6～2.0，全葉滇芎、木里滇芎、紫脈滇芎和波棱滇芎的氣孔形狀為卵圓形(圖版Ⅱ，B3、C3、E3、F3)，其長寬比L/W為1.3～1.6。滇芎屬植物氣孔器的長為14.90～25.40 μm，寬為9.76～17.49 μm，其中全葉滇芎的氣孔器最大，木里滇芎的氣孔器最小。滇芎屬植物氣孔器的內緣為波狀、淺波狀、嚙蝕狀，氣孔器的外拱蓋形態為隆起或較扁平。在掃描電鏡下7種滇芎屬植物葉表皮的微形態特征詳見表3。

表2 滇芎屬7種植物花粉形態特征

表3 滇芎屬7種植物葉表皮微形態特征

3 討 論

3.1 花粉形態在滇芎屬中的分類意義

傘形科的分類主要把果實的形態作為其分類依據，屬間及屬下物種分類困難，因此需要更多的形態特征來作為其分類依據。前人的研究發現花粉的形態特征為傘形科的分類提供了重要信息。滇芎屬的屬下種間界限一直以來都存在問題，因此增加花粉形態作為其分類依據有助于厘清滇芎屬下的種間關系以及系統發育關系。

本研究發現，滇芎、全葉滇芎、麗江滇芎、波棱滇芎的花粉形態相似，赤道面觀均為菱形，極軸與赤道軸之比P/E分別為1.28、1.22、1.45和1.48，均小于1.5。極面觀為三角形或三角圓形，萌發孔為角孔，赤道區外壁紋飾皆為典型的腦狀紋飾，其中麗江滇芎的赤道區外壁紋飾為片狀腦紋，其余3種皆為短棒狀腦紋。這些特征表明上述4種滇芎屬植物均屬于菱形花粉，此類型花粉為傘形科中最為原始的花粉類型。這表明滇芎、全葉滇芎、麗江滇芎和波棱滇芎在滇芎屬中處于較原始的地位。

紫脈滇芎和小滇芎的赤道面觀為橢圓形，極軸與赤道軸之比P/E分別為1.69和1.74，均大于1.5，小于2.0。紫脈滇芎的極面觀為三角形，小滇芎的極面觀為鈍三角形，角孔，赤道區外壁紋飾皆為短棒狀腦紋。這2種花粉屬于橢圓形花粉類型，是一種過渡花粉類型，比菱形花粉進化。這表明紫脈滇芎和小滇芎是滇芎屬內較為進化的種，可能是由滇芎屬內的原始物種逐漸分化而來的。

木里滇芎的赤道面觀為近矩形，極軸與赤道軸之比P/E為2.07，大于2.0。極面觀為鈍三角形，角孔，赤道區外壁紋飾為短棒狀腦紋。這種花粉屬于近矩形花粉類型，是傘形科里一種比較進化的花粉類型。這表明木里滇芎為滇芎屬內最為進化的物種。

滇芎屬內物種的演化趨勢是從滇芎、全葉滇芎、麗江滇芎、波棱滇芎等較原始的種，逐漸分化為紫脈滇芎和小滇芎等較為進化的種，最后發展成木里滇芎等最為進化的種類。這與王萍莉等[23]的研究存在沖突，對滇芎和木里滇芎的研究結果不一致，但是分子證據[35]支持本研究結果。滇芎屬的花粉在萌發孔類型，外壁紋飾上均無顯著的種間差異，這表明花粉形態并沒有發生急劇的演化，這可能是因為分歧時間較短，或者是花粉形態對于環境選擇壓力較為穩定。

波棱滇芎和小滇芎在外形上極為相似，在野外僅根據有無主莖來將它們區分開來。且它們的分布地存在重疊，波棱滇芎在中國主要分布在云南的德欽，西藏的亞東、聶拉木等地；小滇芎主要分布在西藏的聶拉木，波棱滇芎的分布范圍更廣。由于它們在形態上的相似性，Pimenov[3]認為波棱滇芎和小滇芎是一個物種。從花粉形態來看，波棱滇芎是較為原始的菱形花粉，而小滇芎是比較進化的橢圓形花粉，可以看出小滇芎的花粉是比波棱滇芎的花粉更為進化的，可以根據花粉特征將兩個種區分開來，但是在赤道面紋飾和萌發孔的類型上，這兩個物種存在一定的一致性。

3.2 葉表皮微形態在滇芎屬中的分類意義

對滇芎屬7種植物的葉表皮微形態的觀察結果表明：滇芎屬植物的葉表皮大都沒有明顯的細胞輪廓，只有木里滇芎可見多邊形的細胞輪廓。角質膜紋飾都具有明顯或不明顯的條紋。故滇芎屬植物在細胞形狀和角質膜紋飾都不具顯著的差異，表現出一定的穩定性。在氣孔的分布、氣孔形狀、氣孔的內緣形態以及外拱蓋形態上出現了一定的種間差異。滇芎、麗江滇芎、紫脈滇芎和波棱滇芎的氣孔只在遠軸面有分布，全葉滇芎、木里滇芎和小滇芎的氣孔在近軸面和遠軸面皆有分布，其中，木里滇芎的氣孔在近軸面分布的密集程度要大于全葉滇芎和小滇芎；氣孔形狀為橢圓形的有滇芎、麗江滇芎和小滇芎，氣孔形狀為卵圓形的有全葉滇芎、木里滇芎、紫脈滇芎和波棱滇芎；滇芎、木里滇芎、小滇芎的氣孔內緣為淺波狀，全葉滇芎、麗江滇芎和波棱滇芎的氣孔內緣為波狀，而紫脈滇芎的氣孔內緣為嚙蝕狀；紫脈滇芎、波棱滇芎及小滇芎氣孔的外拱蓋為較扁平的，其余4種滇芎植物氣孔的外拱蓋均隆起。滇芎屬植物的每個種都有其特定的葉表皮微形態特征，所以葉表皮微形態特征也可以作為一項重要的分類依據，幫助解決滇芎屬的種間親緣關系問題。根據7種滇芎屬植物的葉表皮微形態特征，編制分類檢索表如下。

對于波棱滇芎和小滇芎的親緣關系問題，從葉表皮微形態來看，波棱滇芎與小滇芎均不具清晰的細胞輪廓，近軸面的角質膜紋飾均為條紋紋飾，但是波棱滇芎遠軸面的角質膜接近光滑，而小滇芎遠軸面的角質膜紋飾依然為密集的條紋紋飾。波棱滇芎的氣孔形狀為卵圓形，小滇芎的氣孔形狀為橢圓形，二者氣孔的外拱蓋均為較扁平的類型，內緣為波狀或淺波狀。上述葉表皮微形態特征在波棱滇芎和小滇芎之間展現出一定的變化，然而在某些特征上也存在一定的相似性，所以本研究結果不支持Pimenov[3]把這兩個種合并為一個種的處理，但是這兩個種的親緣關系應該比較近。分子研究[35]也表明，這兩個物種完全分開了，且在滇芎屬中的親緣關系最近，是姐妹類群。

本研究結果表明，花粉形態和葉表皮微形態特征對于滇芎屬的分類具有一定的參考價值，可以幫助解決依靠宏觀形態難以解決的種間分類問題。然而，從Pimenov[3]的研究看來，中國滇芎屬的種類還不只有《Flora of China》上面記載的8種，更多的種類還需要進一步的研究，該屬更大范圍的花粉形態以及葉表皮微形態還有待研究。

圖版Ⅰ電鏡下滇芎屬植物花粉形態
A. 滇芎；B. 全葉滇芎；C. 木里滇芎；D. 麗江滇芎；E. 紫脈滇芎；F. 波棱滇芎；G. 小滇芎；1. 極面觀；2. 赤道面觀；3. 赤道面紋飾
PlateⅠ Pollen morphology ofPhysospermopsisH.Wolff under SEM
A.P.delavayi; B.P.alepidioides; C.P.muliensis; D.P.shaniana; E.P.rubrinervis; F.P.obtusiuscula; G.P.kingdon-wardii; 1. Polar view; 2. Equatorial view; 3. Equatorial sculpture

圖版Ⅱ電鏡下滇芎屬植物葉表皮微形態
A.滇芎；B.全葉滇芎；C.木里滇芎；D.麗江滇芎；E. 紫脈滇芎；F. 波棱滇芎；G. 小滇芎；1. 近軸面；2. 遠軸面；3. 氣孔
PlateⅡ Leaf epidermal micro-morphology ofPhysospermopsisH.Wolff under SEM
A.P.delavayi; B.P.alepidioides; C.P.muliensis; D.P.shaniana; E.P.rubrinervis; F.P.obtusiuscula; G.P.kingdon-wardii; 1. Adaxial epidermis; 2. Abaxial epidermis; 3. Stoma